文献解读：通过微生物组研究锡金喜马拉雅温泉含硫泥浆沉积物的宏病毒组及其功能多样性

研究简介
2020年9月，印度锡金大学生命科学学院Sayak Das研究团队在Current Research in Microbial Sciences发表了题为Metavirome and its functional diversity analysis through microbiome study of the Sikkim Himalayan hot spring solfataric mud sediments的研究论文。文章描述了北锡金两个温泉NYS和OYS含硫泥浆沉积物样本的病毒群落。研究首先系统描述了样本的微生物组成，接着分析了两个微生物群落的Alpha多样性指数和样本间的beta多样性指数。随后从不同分类水平描述了两个温泉含硫泥浆沉积物样本的病毒物种分布。最后进一步分析了宏病毒组的功能多样性和功能特征。这是迄今为止有关锡金温泉病毒组的第一份研究报告。

研究结果
该研究从印度锡金Yume Samdung valley两个温泉的18个样本点（图1）展开取样。两个温泉的地理位置相近，取样时温泉温度分别在61℃(NYS)和57℃(OYS)。NYS样本测得共计49.57M双端reads，OYS样本测得共计56.68M双端reads。过滤后得到分别34.59M和40.32M reads(Q30)。通过Kracken2联合Bracken实现物种分类，发现在NYS样本的微生物组中，含有占总序列约0.17%的病毒(16,958条reads)，而在OYS样本的微生物组中，含有占总序列约0.07%的病毒(3596条reads)。从NYS和OYS的样本物种含量热图（图2）中可以明显看出温泉微生物组中细菌和真菌的reads占比高于病毒。

图1：New Yume Samdung Tsha/Tatopani (NYS) 样本点（图左）和Old Yume Samdung Tsha Chu/Tatopani (OYS) 样本点（图右）

图2：NYS和OYS的样本物种含量热图

为了比较两处温泉样本病毒组的物种组成差异，计算了每个样本的Alpha多样性指数包括Simpson Index, Shannon H, Fisher alpha和Chao 1 values（表1）。从结果来看，可以发现OYS的物种多样性相较NYS而言更高。计算了样本之间的beta多样性指数Whittaker Index，其值为0.86965，表明两处温泉的病毒群落组成差异较大。
表1：NYS和OYS的Alpha多样性指数和Beta多样性指数

对两处温泉的泥浆沉积物样本的不同水平物种分类（图3-图8）展示出了两个群落的病毒多样性。研究发现两个温泉都富含dsDNA。并且两个温泉的泥浆沉积物样本中的宏病毒组序列的优势目包括有尾噬菌体目(Caudovirales)、孢疹病毒目(Herpesvirales)和逆转录病毒目(Ortervirales)。此外，研究在NYS温泉样本中发现了属于未分类的巨型DNA病毒的序列；仅在NYS样本中发现具有ds（RT-DNA）的巴德纳病毒(Badnavirus)的序列，并仅在OYS样品中发现具有ss(-)RNA的风疹病毒(Rubulavirus)的序列。

从属水平上看，两温泉样本共有的病毒包括：Pandoravirus（潘多拉病毒）、Mimivirus（拟菌病毒）、Nonanavirus、Alphabaculovirus（α杆状病毒）、Prasinovirus（普拉斯诺病毒）、Fromanvirus、Varicellovirus（水痘病毒）、Phicbkvirus、Marseillevirus（马赛病毒）、Timquatrovirus，它们构成了病毒圈的主要种群。

从种水平上看，两温泉样本共有的病毒包括：BeAn 58,058 virus、Human endogenous retrovirus K（人内源性逆转录病毒K）、Moumouvirus、Pandoravirus salinus、Pandoravirus macleodensis、Megavirus chiliensis、Pandoravirus dulcis、Noumeavirus、Acanthamoeba polyphaga mimivirus、Pandoravirus neocaledonia。

图3：NYS样本中主要病毒群落结构的Krona饼图

图4：OYS样本中主要病毒群落结构的Krona饼图

图5：NYS样本的宏病毒组reads的属水平分类图6：OYS样本的宏病毒组reads的属水平分类

图7：NYS样本的宏病毒组reads的种水平分类图8：OYS样本的宏病毒组reads的种水平分类

根据病毒功能基因多样性分析，发现NYS温泉泥沉积物以细菌噬菌体（六个主要物种）为主导。其中主要的10个物种分别是：肺炎球菌噬菌体Dp-1，棘阿米巴多噬拟态病毒（APMV），葡萄球菌噬菌体L54a，鸡痘病毒（FPV），双斑侧沟茧蜂病毒（MdBV），埃希氏菌噬菌体Mu，芽孢杆菌噬菌体phi105，棉铃虫颗粒病毒（HaGV），埃希氏菌噬菌体lambda和大肠杆菌噬菌体N15。相似地，在OYS温泉泥沉积物中，也是细菌噬菌体（八个主要物种）占主导地位。在OYS温泉的宏病毒组功能序列中发现了一种主要的古细菌噬菌体ATV。OYS样本中主要的10个物种分别是：芽孢杆菌噬菌体SPbeta、埃希氏菌噬菌体P1、肺炎球菌噬菌体Dp-1、棘阿米巴多噬拟态病毒（APMV）、埃希氏菌噬菌体λ、酸菌双尾病毒（ATV）、沙门氏菌噬菌体P22、艾克沙门氏菌病毒、大肠埃希氏菌噬菌体λ和大肠埃希氏菌噬菌体Mu。

研究使用基于四核核苷酸频率的平均距离矩阵，计算了两个样本共有的宏病毒组圆形网络模型。每个病毒的序列作为一个单节点，节点大小取决于连接到节点的边权重，网络的边显示出病毒基因组及其核苷酸频率丰度的相关性，边的权重与节点之间的频率相关。病毒组的网络分析图展示出了它们对真核生物，细菌和古细菌共同宿主的概率相互依赖性。

图9：基于四核苷酸频率的平均距离矩阵的宏病毒组网络分析图

结论：

该研究利用锡金两个温泉含硫泥浆沉积物的宏基因组数据，分析了该生态系统中宏病毒组的组成及其功能多样性。研究通过Alpha多样性和beta多样性展示了两个群落的多样性特征，描述了两个取样地点的群落结构、共有的病毒种类和两地特有的物种。研究根据病毒功能基因多样性，发现细菌噬菌体是两处温泉泥沉积物样本中最主要的成分。此外，根据四核苷酸频率的平均距离矩阵构建了共有病毒网络分析图，展示出它们共同宿主的概率相互依赖性。这些发现可以作为可培养病毒学研究动态的依据。

参考文献：

Das, S., Kumari, A., Sherpa, M. T., Najar, I. N., & Thakur, N. (2020). Metavirome and its functional diversity analysis through microbiome study of the Sikkim Himalayan hot spring solfataric mud sediments. Current Research in Microbial Sciences. doi:10.1016/j.crmicr.2020.05.002

文中病毒组研究方法：

序列组装采用的是metaSPADES assembler (Nurk et al., 2017)。该软件是目前宏基因组领域组装指标较好的软件，尤其在株水平组装优势明显。
组装结果分箱采用的工具是MaxBin 2.0 (Wu et al., 2016)。Maxbin考虑每个contig的序列覆盖度和四碱基频率，以记录每个bin的marker基因数量。
分类采用的是Kraken2 (Wood et al., 2019)，参考数据库包含所有的Ref-Seq细菌、古细菌、真菌和病毒基因组。Bracken (Lu et al., 2017)用来评估从种水平到门水平的不同微生物丰度。
采用Prodigal (Hyatt et al., 2010)对蛋白质编码基因（ORFs）进行预测，采用ARAGORN(Laslett and Canback, 2004)对tRNA基因进行预测，并且采用rRNAFinder(Wheeler and Eddy, 2013)对核糖体RNA基因进行鉴定和分类。
计算多样性指数、稀疏曲线和网络分析采用的软件是PAST (Najar et al., 2020)。

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