易基因｜3文聚焦：宏病毒组测序在肠病中的应用研究

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。本期我们通过3篇高分文章来解读宏病毒组测序在肠病中的应用研究。

01 小鼠结肠炎研究揭示噬菌体在疾病发生中的作用

标题：Murine colitis reveals a disease-associated bacteriophage community（小鼠结肠炎研究揭示噬菌体在疾病发生中的作用）

期刊：Nature Microbiology

影响因子：17.75

发表时间：2018.09

摘要

肠道微生物群落的失调与炎症性肠病(IBD)有关。目前已知的微生物群落对炎症性疾病的作用的研究主要集中在细菌上，然而肠道中含有一种由被称为噬菌体的原核生物病毒主导的病毒成分。IBD发生时肠粘膜表面噬菌体数量增加，噬菌体丰度增加，这表明噬菌体在IBD中起着未知的作用。作者应用宏基因组来研究小鼠结肠炎模型中的肠道噬菌体。研究发现，在IBD期间，肠道噬菌体种群发生了改变，从有序状态转变为随机的生物失调。作者鉴定了与肠道疾病相关的致病宿主的特异性噬菌体，其丰度在IBD期间会发生变化。此外，健康和患病小鼠的噬菌体种群与健康人和患有IBD的人的噬菌体重叠。作者的研究结果表明，肠道噬菌体群落在炎症性疾病期间发生了改变，为研究噬菌体在IBD中的作用机制提供了一个新思路。

结果

IBD是一类疾病的总称，其中包括常见的克罗恩病和溃疡性结肠炎。所有这些疾病都涉及到了具有慢性炎症的胃肠道系统，包括不同性质和严重程度的患者。患者大多在疾病初期没有任何症状，然后突然发病。目前这一疾病的成因尚不明确。在美国，这一类疾病的患者规模达到了160万人。

在研究中，作者搜集了T细胞转移性肠炎模型小鼠的排泄物，用基因测序的方法分析了小鼠排泄物中噬菌体的基因数据并于健康野生鼠的基因数据进行对比。随后，根据NCBI数据库内的信息对这些基因所从属的肠道菌群变化进行追踪。结果显示在T细胞转移的小鼠模型中，肠道菌群的菌属构成所发生的变化与炎症性肠炎患者的肠道的变化相一致。之后研究人员持续地跟踪检测了小鼠模型中噬菌体群落的变化现象，T移植小鼠模型与健康小鼠模型相比，噬菌体构成在实验第42天发生了较大差异，结果与NCBI中的数据相吻合。

宿主炎症对噬菌体群落的干扰因素有很多，比如在这种情况下，有的噬菌体可能会把基因组插入到细菌中形成溶源性细菌，炎症环境也会刺激部分噬菌体增殖，从而造成噬菌体丰度的改变。作者认为如果可以阻止部分噬菌体对益生菌的破坏，那么就可能会起到疾病治疗的功效。

最后，为了确定小鼠VLP序列reads是否与人类的肠道噬菌体匹配，作者将来自健康人和结肠炎动物的VLP reads比对到来自健康人和患有IBD的人的噬菌体的数据集中。结果表明共有38个重叠，占健康人类噬菌体的25%，这些数据表明小鼠噬菌体的健康成分与人类的重叠，并且这些噬菌体的丰度在结肠炎期间减少。接下来，作者评估了VLP reads的丰度，这些VLP reads被比对到一组519个VLP重叠群上，共有169个重叠群，占IBD患者产生的VLP重叠群的33%。因此，在肠道健康和疾病期间，小鼠噬菌体与人类的噬菌体重叠。

这项研究不但证实了噬菌体种群的变化与炎症的相关性，还说明了在IBD中肠道菌群所可能起到的作用。

02 人样本：宏病毒组分析揭示炎症性肠病中的暗物质

标题：Whole-Virome Analysis Sheds Light on Viral Dark Matter in Inflammatory Bowel Disease. （宏病毒组分析揭示炎症性肠病中的暗物质）

期刊：Cell Host & Microbe

影响因子:21.023

发表时间：2019.10

摘要

人类肠道病毒对人体微生态和人类健康有重着大影响。然而，大多数病毒分析都是在有限的已知病毒上进行的。作者通过对已发表的炎症性肠病(IBD)和溃疡性结肠炎数据进行宏病毒组分析，发现了IBD中的人类肠道病毒组成。在克罗恩病患者中，作者观察到IBD特异性的病毒组变化和温和噬菌体序列的增加。在IBD受试者中，病毒组成的变化反映了细菌组成的变化。此外，结合细菌组和病毒组的数据可以更好地区分健康人和患者。这种跨队列分析整个病毒组的方法突出了IBD信号的重要性，这可能对未来开发疾病生物标记物和治疗药物至关重要。

数据集

作者重新分析了之前发表的健康人和IBD患者的肠道病毒组数据。数据集由来自130名受试者的165份病毒样本组成，其中包括61名健康对照、27名CD（克罗恩病）患者和42名UC（溃疡性结肠炎）患者。

结果

作者采用新的分析方法对序列进行过滤和组装，重新分析了已发表的健康者和IBD患者肠道病毒的数据库。过去的研究方法是将经过质量筛选的reads与最终的病毒样序列（VLSs）比对，数据集在90%的长度上标识为非冗余。由于VLSs代表高度相关的病毒组，因此研究主要在菌株或物种水平上进行分析，从而反映个体差异是分离和组合纵向样本的主要因素，然而掩盖了个体间病毒组的成分差异，病毒样序列(VLSs)疾病特异性的变化不显著。为了进一步确定聚类的VLSs是否能克服个体间差异，作者绘制了VLSs和VCs（viral clusters）之间共有的病毒特征的相对丰度(图1C)，结果表明重新分析在聚类上能够较好地克服个体差异。

接着作者通过差异丰度分析发现，与对照组相比，CD组增加了37个VCs, UC组增加了34个VCs。此外，IBD中共有17个被划分为长尾噬菌体科（Siphoviridae）的VCs(CD组中有9个，UC组中有8个)，相对于健康组有所增加，这一结果支持了温和噬菌体丰度增加与疾病相关的理论。新的分析鉴定出许多未知的病毒序列，并发现健康人的肠道病毒组中以由烈性噬菌体组成的稳定核心为主。

最后作者测试了病毒组和菌群组成对IBD患者和健康对照组的区分能力。通过合并CD和UC样本来增加样本量，形成一个复合的IBD队列。最重要的两个致病因子分别与毛螺菌科 (Lachnospiraceae，vc39)和副杆菌属 (Parabacteroides，vc23)相关，其余两个与拟杆菌属(Bacteroides，vc32和vc38)相关。这些发现进一步证明了肠道病毒组变化会影响肠道细菌组成的变化。将病毒组与16S数据进行合并，再次分析预测能力，准确度增加到0.853 (p = 0.0026)。这些结果说明结合细菌组和病毒组数据可更好地将健康人和患者进行区分。

03 人样本：溃疡性结肠炎的肠粘膜病毒改变

标题：Gut mucosal virome alterations in ulcerative colitis（溃疡性结肠炎的肠粘膜病毒改变）

期刊：Gut

影响因子:23.059

发表时间：2019.07

摘要

溃疡性结肠炎（UC）的发病机制与肠道菌群失调有关。作者推测，在病毒群落中，肠道黏膜的改变在UC发病机理中起着重要作用。在研究中，作者对来自中国三个不同区域（UC= 91；健康对照组= 76）的167名受试者的直肠黏膜进行了宏病毒组测序分析和细菌16S rRNA测序，评估UC黏膜中的病毒和细菌的改变。作者用medoids聚类算法将黏膜病毒分为黏膜病毒亚群1和2，本研究首次证实了UC患者具有绿脓杆菌黏膜实质性改变和功能性畸变的菌群特征。溃疡性结肠炎黏膜中尾状病毒噬菌体的富集、噬菌体/细菌毒力功能的增强和病毒-细菌相关性的缺失等研究结果表明，黏膜病毒组可能在UC发病机制中发挥重要作用。

队列选择

本研究选择了63例UC患者和48例香港健康患者的临床队列。此外，在知情同意的情况下，还招募了20名健康受试者和来自北京的20例UC患者，以及8名健康受试者与来自浙江省象山的8例UC患者（全部为中国人）。

结果

作者比较了63例UC患者和48位健康受试者的黏膜病毒，在物种水平上，与健康受试者相比，UC受试者表现出黏膜病毒组多样性和丰富度降低。结果显示UC患者的黏膜病毒，尤其是有尾噬菌体有增生，与健康对照组相比，黏膜有尾噬菌体的多样性，丰富性和均匀性则有所下降。总的来说，这些发现表明溃疡性结肠炎患者黏膜病毒组发生的变化，且这种改变与肠道炎症有关。

通过非度量多维标度（NMDS）分析，作者发现UC的黏膜病毒之间的个体差异高于对照组，这表明UC的病毒组的改变是高度个体化的。通过DESeq分析发现，大肠杆菌噬菌体和肠杆菌噬菌体在UC中的含量高于对照组，原核病毒尤其是尾病毒噬菌体在溃疡性结肠炎黏膜中的差异尤为显著，而一些真核病毒在健康人体内更为丰富，这表明细菌失调与溃疡性结肠炎的噬菌体扩张之间存在关联。

由于观察到的黏膜病毒亚群之间高度不同，作者研究了健康人和UC患者中黏膜病毒组的富集。通过在medoids聚类算法将黏膜病毒分为黏膜病毒亚群1和2，与亚群1相比，亚群2以UC患者为主，并且显示出各种病毒种类的大量损失。UC患者表现出多种病毒功能的明显丧失，而多种病毒功能，特别是与宿主细菌适应性和致病性相关的噬菌体功能，在UC黏膜中明显富集。

为了评估黏膜病毒的功能，作者比较了预测的健康人和UC患者间黏膜病毒组功能。尽管健康人和UC之间最丰富的功能在丰度上没有差异，但健康个体在GO和Pfam蛋白功能方面表现出更丰富的病毒组功能，而UC受试者表现出明显的功能缺失。尽管如此，一些分子功能被确定在UC中比在健康黏膜病毒组中更丰富，包括DNA模板转录负调控、β-内酰胺酶、谷氨酰胺氨基转移酶、糖水解酶、II/IV型分泌系统和多铜氧化酶，这些都与噬菌体对宿主的裂解作用以及细菌来源有关。这些结果表明，UC患者黏膜病毒功能的丰富与细菌适应度、致病性和耐药性有关。

为了描述黏膜细菌组和病毒组之间的关系，作者评估了细菌和病毒组α多样性（多样性、均匀性和丰富度）之间的相关性。结果表明，UC中的病毒-细菌-微生物群关系发生了变化，病毒和细菌之间的相互联系变得更少，更加专门化，进一步暗示了黏膜病毒和细菌之间的平衡对人类健康的重要性。

易基因小结：噬菌体在肠道中的作用

噬菌体可以通过裂解肠道内的原核细胞（溶菌作用）或通过向基因组整合基因（溶原作用），它可以改变细菌的表面结构，从而影响细菌与宿主的相互作用，或改变细菌的适应度和表型，赋予抗生素耐药性，产生毒素或增加能量产出的能力。因此，肠道噬菌体不仅是捕食者，而且可以通过提供基因来帮助寄主，从而在它们共同生活的生态系统中形成竞争优势。

关于宏病毒组测序

病毒宏基因组学（Meta- virome）是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支，是某类样本中所有病毒（ virus）或病毒类似物irus-like- particle）及其所携带遗传信息的总称。宏病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具有重要作用。宏病毒研究可应用于人或动物肠道或者血液样本、海洋、土壤等的研究，用以挖掘潜在的对人类和环境的危害。

深圳易基因科技与丹麦哥本哈根大学知名微生物课题组联合开发高效的宏病毒组颗粒富集方法，可对微量样本进行病毒颗粒富集，并保证病毒活性及高均质性，为宏病毒组学、噬菌体与细菌之间的互作关系等研究提供优良技术支持，保驾护航！

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参考文献：

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.10.009

https://www.nature.com/articles/s41564-018-0210-y

https://gut.bmj.com/content/68/7/1169

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