二代测序之SNV检测总结笔记

文章目录

二代测序之SNV检测总结笔记
- Short variant calling的流程：
- - 测序常见错误：
- Germline：HaplotypeCaller （单倍体） in GATK
- 过滤候选的Variant信息
- - 筛选流程：
- Somatic Calling Workflow（Mutect2）
- 参考资料：

Short variant calling的流程：

比对好的肿瘤样本的Reads和参考基因组做比对获得全部的在肿瘤中发现的突变mutations，比对好的正常样本的Reads和参考基因组做比对获得胚系突变germline mutations，这两个之间的差别很大程度上是somatic mutations,且该结果是来源于上百万的细胞的平均值，而非单细胞的数据，是从群体层面来看的平均效果。

变异的检测相对基因型的检测更困难和一般，基因型决定一系列的等位基因具体的变异，而等位基因的数量是确定的，通常人类是二倍体，特殊只需考虑SNPs和单倍体的情况。

而变异的检测就需要考虑癌症基因组可能出现：拷贝数的变化，肿瘤的异质性，制备文库时出现肿瘤和正常的混合污染，混合的潜在性非二倍体的基因型。

其中Coverage为测序深度。位置2,4,8出现了变化的碱基，最后一个只出现了一个C，可能是测序错误，所以放弃。

Allele Fraction（AF）：指Reads中多少个reads支持替代的碱基的比例

AF = （n[多少个变化的碱基]+1）/(N[Reads中该位置总共多少个碱基]+2)%

据课程所知：+1是统计上解决样本容量较低（造成频度估计不准）一种常见的trick。另一种常见近似是+2（两种类型的结果频数各加上2，相当于总样本量+4）

测序常见错误：

文库制备过程中

1.混杂各种细胞导致污染，如细菌，肿瘤正常细胞，微生物等的混杂

2.引入技术序列（如接头序列）
测序过程中
比对过程中

Germline：HaplotypeCaller （单倍体） in GATK

基于java软件的variant calling的软件，应用于germline的分析。

流程：

根据比对好的bam文件去筛选哪一些是存在显著变异的区域[active regions]

对候选区域的reads挑出来进行重新的拼接[re-assembly],拼接可能得到单倍型。

对各种各样的单倍型进行一个定性的评价[likelihoods],这里使用PairHMM模型。
根据倍型的组合，把germline的变异的位点挑出来[SWA(Smith-Waterman alignment)]。

过滤候选的Variant信息

碱基质量(base qualities) ：低质量暗示着测序错误
Read位置：偏差暗示着匹配错误
基因组链[Genomic strand]：偏差暗示着匹配错误
基因组位置：是否存在PCR重复序列，self-chain[染色体之间相似性的比较]，homoploymers均聚物[地复杂区域]
匹配信息：算法相关的质量分数

根据以上的这些进行过滤筛选。

筛选流程：

最后根据dbSNP数据库进行判断，筛掉SNP，获得突变的信息。

Somatic Calling Workflow（Mutect2）

参考资料：

https://www.bilibili.com/video/BV1oQ4y1P7fD?share_source=copy_web
https://blog.csdn.net/tanzuozhev/article/details/84864344?ivk_sa=1024320u

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