二代测序原理及其流程

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序，其开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序，在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定DNA序列。

二代测序有两个重要特点：1．高通量，二代测序能一次并行对几十、几百万条DNA分子进行测序；2．读长短，测序过程随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，会导致测序质量下降，二代测序的读长不超过500bp。因此基因组、宏基因组需要被打断成小片段再测序，测序完毕后再拼接。下面以Illumina测序法为例介绍二代测序原理及流程：

一、文库构建

PCR产生的片段或基因组打断的片段两端需要添加接头（Adaptor）修饰才能进行测序。

1．末端修饰。打断的片段是随机断裂，其末端可能是不平的。因此，建库第一步是补齐不平的末端。

2．添加接头。经过末端修饰后的DNA片段3’末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端，形成“Y”形接头。加接头是为了区分样本。

3．PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可通过与接头互补的引物来扩增，富集文库。

二、上机测序

单链化的文库DNA片段进入Illumina测序平台的流通池后，可以与流通池表面的寡核苷酸结合，从而进入测序过程。测序具体流程如下：

1．首先以寡核苷酸（2个）为引物、文库片段为模板进行DNA复制。复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的是与文库模板互补的DNA链。

2．“桥”式扩增。单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，进行“桥”式扩增。扩增25~28个循环完成后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，基因簇在测序时比单分子产生的光信号强很多，更易于检测到。

3．边合成边测序。流通池中加入测序引物Read1 SP、DNA聚合酶，连有不同颜色的可逆终止荧光基团的dNTP，一个循环只能延长一个碱基，然后清除游离的dNTP，使用激光扫描，判断是哪种碱基。一个循环结束之后就加入一些化学试剂把叠氮基团和标记的荧光基团切掉，使3’端的羟基暴露出来，再加入新的dNTP和聚合酶进入下一个碱基的测序反应。

4．Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），这时会继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个位点的DNA属于哪个文库。

二代测序技术相对一代测序大大降低了测序成本并大幅提高了测序速度，应用非常广泛，如突变体的定位，寻找SNP位点，全基因组甲基化测序等。二代测序技术在此次新型冠状病毒疫情防控中发挥了很大的作用，直接通过测序掌握了该“不明原因肺炎”的基因组序列，从而进一步研发出相关检测试剂，以助于我们快速地搜索和排除病例，对于我国快速有效地控制疫情有重大的意义。