为进一步提高《微生物组实验手册》稿件质量，本项目新增大众评审环节。文章在通过同行评审后，采用公众号推送方式分享全文，任何人均可在线提交修改意见。公众号格式显示略有问题，建议电脑端点击文末阅读原文下载PDF审稿。在线文档(https://kdocs.cn/l/cL8RRqHIL)大众评审页面登记姓名、单位和行号索引的修改建议。修改意见的征集截止时间为推文发布后的72小时，文章将会结合有建设性的修改意见进一步修改后获得DOI在线发表，同时根据贡献程度列为审稿人或致谢。感谢广大同行提出宝贵意见。

微生物DNA、RNA和蛋白质共提取方法

A Method for Co-extraction of Microbial DNA, RNA, and Protein

刘思佳¹，赵圣国^{1, *}

¹动物营养学国家重点实验室，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京

*通讯作者邮箱：zhaoshengguo@caas.cn

摘要：基因组、转录组和蛋白组等多组学关联分析对研究微生物群落结构组成与变化、功能特征及其与宿主表型关联等具有重要意义。多组学分析有必要对样本DNA、RNA和蛋白质进行共提取，用于后续测序或质谱测定，这将大大减少试验样品误差和减少珍贵样品用量。本文利用TRIZOL试剂可以将DNA、RNA和蛋白质分层的原理，同时提取微生物的这三种生物大分子物质，具有简便快捷、引入误差少的优势。

关键词: 微生物，DNA，RNA，蛋白质，共提取

材料与试剂

1.50 ml离心管 (D/RNase-Free)  (TIANGEN，catalog number: CT-002-50-01)

2.15 ml离心管 (D/RNase-Free)  (TIANGEN，catalog number: CT-002-15-01)

3.1.5 ml离心管 (D/RNase-Free)  (TIANGEN，catalog number: HC117-02)

4.TRIZOL (Invitrogen，catalog number: 15596018)

5.三氯甲烷 (Dr. Ehrenstorfe，catalog number: L17739500ME)

6.异丙醇 (国药，catalog number: 8010921801)

7.无水乙醇 (国药，catalog number: 1000925901)

8.DNase I (TaKaRa，catalog number: 2212)

9.RNase Inhibitor (Takara，catalog number: 2313A)

10.DEPC H₂O (Invitrogen，catalog number: 750024)

11.10× PCR buffer (Sigma-Aldrich，catalog number: 11699121001)

12.dNTP mixture (10 mM) (Takara，catalog number: 4019)

13.Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen，catalog number: 10966018)

14.柠檬酸钠 (Sigma-Aldrich，catalog number: 71402-250G)

15.NaOH (Sigma-Aldrich，catalog number: S5881-1kg)

16.盐酸胍 (生工，catalog number: A510243-0100)

17.SDS (Macklin，catalog number: S817788-100g)

18.超纯水 (D/RNase-free) (BI，catalog number: 01-866-1B)

19.RNA纯化试剂盒 (TIANGEN，catalog number: DP412)

20.Bradford蛋白定量试剂盒 (Bestbio，catalog number: BB-3411)

仪器设备

1.全自动冷冻研磨仪 (德国RETSCH，catalog number: Cryomill)

2.生物分析仪 (Agilent Technologies，catalog number: 2100)

3.涡旋震荡仪 (Scientific Industries，catalog number: vortex-genie2T)

4.离心机 (SIGMA，catalog number: 3-18k)

5.水浴锅 (TIANDZ，catalog number: DZKW-S-6)

6.NanoDrop^TM光谱仪 (Thermo Scientific，catalog number: 2000)

7.Qubit荧光定量仪 (Invitrogen，catalog number: 2.0)

8.电泳仪 (Bio-Rad，catalog number: CHEF Mapper)

9.PCR仪 (Thermofisher，catalog number: Veriti 96-Well Thermal Cycler)

实验步骤

一、样品前处理

1.采集微生物样品，置于液氮保存。

2.取约5 ml（或5 g）液氮冻存的微生物样品，置于研磨罐 (50 ml) 中，加入1颗20 mm和10颗5 mm钢珠，利用全自动冷冻研磨仪在振动频率为30 Hz条件下研磨5 min，研磨完成后取出置于50 ml 离心管。

3.加入5 ml TRIZOL溶液充分混匀，室温放置5 min。

4.加入0.2倍体积的三氯甲烷溶液，涡旋混匀15 s，放置3 min后离心 (12,000 × g，4 °C，15 min)。离心后分为三层，上层为RNA，中层为蛋白质，下层为DNA。

二、总RNA提取^[1,2,3]

1.取上层水相RNA到新的50 ml离心管 (RNase-Free) 中,加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min，或-20 °C放置1 h，离心 (12,000 × g，4 °C，15 min)。

2.弃上清，添加与异丙醇等量的预冷75%乙醇，使用移液枪轻轻将整块沉淀吹起悬浮，离心 (7,500 × g，4 °C，10 min)，弃乙醇溶液。

3.在室温放置5-10 min，直至干燥。

4.加入100 μl超纯水 (RNase-free)，水浴 (55-60 °C) 10-15 min，促进RNA溶解。

5.利用RNA纯化试剂盒纯化，去除无机离子等杂质，按说明书操作。

6.DNase I (RNase-free) 消化去除RNA溶液中gDNA，反应体系为20 μl RNA溶液，5 μl 10× DNase I Buffer，2 μl DNase I，0.5 μl RNase Inhibitor，22.5 μl DEPC H₂O。37 ℃孵育25 min。

7.利用RNA纯化试剂盒纯化，去除DNase I以及gDNA消化物，得到纯净的RNA溶液。

8.利用细菌通用引物27F 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 检测RNA溶液中是否有gDNA残留。PCR反应体系为25 μl，包括：2.5 μl 10x PCR buffer，0.5 μl dNTP mixture, 1 μl 27F引物(10 μM)，1 μl 1492R引物 (10 μM)，0.25 μl Platinum Taq DNA polymerase, 1 μl RNA溶液，18.75 μl 超纯水；反应程序为：首先94 °C 5 min，随后94 °C 30 s，54°C 30 s，72 °C 1 min 30 s 35个循环，最后72 °C 10 min 。利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

9.使用生物分析仪检测RNA浓度和完整性。

10.RNA样品置于-80 °C保存。

三、总DNA提取

1.取中间层和下层溶液，加入0.3倍TRIZOL体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置3 min，离心 (2,000 × g，5 min)。将上清液保存到新的50 ml离心管中 (用于蛋白质的分离)。

2.在沉淀中加入与TRIZOL等体积的0.1 M的柠檬酸钠溶液，室温静置30 min, 离心 (2,000 × g，4 °C，5 min)，弃上清。重复该步骤一次。

3.室温放置10 min，干燥DNA。

4.加入50-100 μl 8 mM NaOH溶液，混匀重悬DNA。

5.利用NanoDrop^TM光谱仪、Qubit荧光定量仪对DNA质量和浓度检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA完整性进行检测。

6.DNA样品置于-20 °C或-80 °C保存。

四、总蛋白质提取^[4]

1.取步骤三 (1) 中的上清液，加入1.5倍TRIZOL体积的异丙醇，室温静置10 min，离心 (12,000 × g，4 °C，10 min)。

2.弃上清，加入2倍TRIZOL体积的0.3 M盐酸胍溶液，室温静置20 min，离心 (7,500 × g，4 °C，10 min)，弃上清。此步骤重复3次。

3.加入2倍TRIZOL体积的无水乙醇，涡旋混匀，室温静置20 min，离心 (7,500 × g，4 °C，10 min)，弃上清。

4.室温干燥10 min,重悬于1% SDS溶液，50 °C孵育10 min。

5.利用Bradford蛋白定量试剂盒检测蛋白质浓度。

6.蛋白质样品置于-20 °C或-80 °C保存。

溶液配方

1.0.1 M 柠檬酸钠溶液：25.807 g 柠檬酸钠，用10%乙醇溶液定容至1000 ml。

2.10%乙醇溶液：10 ml 无水乙醇，用超纯水定容至100 ml。

3.0.8 mM NaOH溶液：0.032 g NaOH，用超纯水定容至1000 ml。

4.0.3 M盐酸胍溶液：28.659 g 盐酸胍，用95%乙醇定容至1000 ml。

5.95%乙醇溶液：95 ml 无水乙醇，用超纯水定容至100 ml。

6.1% SDS溶液：1 g SDS，用超纯水定容至100 ml。

7.75%乙醇溶液：75 ml 无水乙醇，用超纯水定容至100 ml。

致谢

感谢中国农业科学院创新工程支持

参考文献

1.Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159.

2.Liu, S., Zheng, N., Zhao, S. G. and Wang, J. Q. (2020). Exploring the diversity of active ureolytic bacteria in the rumen by comparison of cDNA and gDNA. Animals 10: 2162.

3.刘思佳，赵圣国，郑楠，王加启. (2020). 瘤胃微生物RNA 提取中样品前处理方法的优化. 微生物学杂志 40(1): 88-93.

4.Hummon, A. B., Lim S. R., Difilippantonio, M. J. and Ried, T. (2007). Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques 42: 467-472.

猜你喜欢

10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature Cell专刊 肠道指挥大脑

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人

一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树

必备技能：提问 搜索  Endnote

文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical

扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图

16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun

在线工具：16S预测培养基 生信绘图

科研经验：云笔记  云协作 公众号

编程模板: Shell  R Perl

生物科普:  肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。PI请明示身份，另有海内外微生物相关PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

点击阅读原文下载PDF审稿，或浏览器直接访问下载链接：http://210.75.224.110/github/MicrobiomeProtocol/04Review/210429/2103998ShengguoZhao980302/protocol2103998revision_Yu.pdf