为进一步提高《微生物组实验手册》稿件质量，本项目新增大众评审环节。文章在通过同行评审后，采用公众号推送方式分享全文，任何人均可在线提交修改意见。公众号格式显示略有问题，建议电脑端点击文末阅读原文下载PDF审稿。在线文档(https://kdocs.cn/l/cL8RRqHIL)大众评审页面登记姓名、单位和行号索引的修改建议。修改意见的征集截止时间为推文发布后的72小时，文章将会结合有建设性的修改意见进一步修改后获得DOI在线发表，同时根据贡献程度列为审稿人或致谢。感谢广大同行提出宝贵意见。

微生物超高分子量DNA提取方法

Super-high Molecular Weight DNA Isolation

赵圣国^{1, *}

¹动物营养学国家重点实验，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所院，北京

*通讯作者邮箱: zhaoshengguo@caas.cn

摘要：随着三代测序的快速发展，对微生物超高分子量DNA (SHMW-DNA) 的需求越来越多，三代测序有助于大大提高微生物基因组或宏基因组组装效率。目前，常用的商业试剂盒或液体试剂提取DNA的方法，受纯化膜或液体剪切力的影响，提取的DNA片段约10-30 kb，无法满足SHMW-DNA的质量要求。本方法采用琼脂糖包埋法，通过胶内裂解和电泳洗脱回收方式，获得SHMW-DNA，分子量达到300 kb以上，将为三代测序尤其是nanopore测序提供重要支撑^[1]。

关键词: 微生物，超高分子量DNA，提取，三代测序

材料与试剂

1.透析袋 (MD34 (8000~14000 Da)，扁平宽度10 mm)

2.0.25 μm滤膜

3.溶菌酶

4.蛋白酶K (冻干粉，≥40 units/mg protein)

5.MidRange PFG Marker I

6.Tris

7.EDTA

8.苯甲基磺酰氟

9.N-月桂酰肌氨酸钠

10.脱氧胆酸钠

11.硼酸

12.冰乙酸

13.聚乙二醇8000

14.低熔点琼脂糖

仪器设备

1.模具 (长 × 宽 × 高约为1 cm × 0.5 cm × 1 cm)

2.脉冲场电泳仪

3.照胶仪

4.恒温烘箱

实验步骤

1.取新鲜采集微生物样品，根据样品特点离心获得微生物细胞，用TE缓冲液重悬细胞，利用平板计数法使得细胞的浓度约为每毫升10⁷-10⁸个。

2.取3 ml加热溶解的1.6%低熔点琼脂糖，温度降至45 °C左右，加入等体积微生物细胞，混匀后立即加入可制成胶块的模具中，4 °C凝固30 min。

3.取出胶块，置于5 倍体积的DNA裂解液中，37 °C静置孵育裂解1 h。

4.把胶块转到与裂解液等体积的ESP缓冲液中，于恒温烘箱50 °C裂解48 h，其间更换一次ESP缓冲液。

5.取10-20倍胶块体积的冰冷TE缓冲液，加入PMSF贮备液至终浓度0.1 mM，置于冰上洗涤胶块3次，每次静置1 h。（PMSF苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂。操作时需佩戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用。）

6.将胶块保存于0.05 M EDTA溶液 (pH 8.0) 中，4 °C保存 (可放置1年)。

7.在照胶仪下观察，用刀片切下含DNA条带的胶块，小心塞进透析袋中，加入20-100 μL 0.5× TBE缓冲液，赶出气泡后两端夹紧透析袋夹。

8.将透析袋放入含4 °C预冷0.5× TBE缓冲液的脉冲场电泳槽中，设置槽温14 °C、电压6 V/cm、脉冲转换时间25 s、转换角度120°、电泳时间5 h，将胶块中的DNA电泳至透析袋溶液中。

9.电泳结束后，将透析袋在电泳槽中水平调转180°，再次电泳1.5 min，将透析膜上的DNA电泳至透析袋溶液中。

10.取出透析袋，打开一侧的透析袋夹，用剪去尖的枪头，小心缓慢的吸出DNA溶液，置于一个1.5 ml的离心管中。

11.用NanoDrop或Qubit对DNA进行定量。

12.利用脉冲场电泳仪进行DNA片段大小分布和降解情况分析，设置电泳条件: 1%琼脂糖凝胶，0.5x TBE缓冲液，温度14 °C，泵速80，电场夹角120º，起始脉冲时间0.1 s，终止脉冲时间40 s，电场强度6 V/cm，电泳时间为16 h。。

结果与分析

该方法提取的DNA整体主条带大于300 kb (见图1)^[2,3]。

图1. 奶牛瘤胃微生物SHWM-DNA脉冲场电泳图

溶液配方

1.0.5 M EDTA溶液 (pH 8.0): 186.1 g EDTA, 20 g NaOH, 加水定容至1 L, 浓盐酸调pH至8.0。

2.0.05 M EDTA溶液 (pH 8.0): 取1 ml 0.5 M EDTA溶液，加入9 ml超纯水。

3.1 M Tris-HCl: 121.1 g Tris碱，42 ml浓盐酸定容至1 L，调pH至8.0。

4.TE缓冲液 (pH 8.0): 10 ml 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0), 加入超纯水定容至1 L。

5.PMSF (苯甲基磺酰氟) 贮备液：用异丙醇溶解配制100 mM的贮存液，4 °C保存。使用前37 °C加热15 min溶解。

6.溶菌酶：用10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 溶解溶菌酶，配制成10 mg/mL浓度的储存液。

7.DNA裂解液：10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl, 0.1 M EDTA, 1% N-月桂酰肌氨酸钠, 0.2%脱氧胆酸钠, 1 mg/ml 溶菌酶。

8.ESP缓冲液：1% N-月桂酰肌氨酸钠, 1 mg/ml 蛋白酶K, 0.5 M EDTA。

9.5× TBE储备液: 54 g Tris, 27.5 g 硼酸，20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 加水至1 L。

10.0.5× TBE工作液：将5× TBE储备液稀释10倍。

11.50× TAE储备液: 242 g Tris, 57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0), 加水定容至1 L。

12.1× TAE工作液：将50× TAE储备液稀释50倍。

13.30%聚乙二醇8000：称取20 g聚乙二醇8000，溶于超纯水中，最后定容到100 ml，0.25 μm滤膜过滤除菌后于4 °C保存。

14.1.6%低熔点琼脂糖：1.6 g低熔点琼脂糖，加入100 ml超纯水中。

致谢

感谢中国农业科学院创新工程 (ASTIP-IAS12) 支持，感谢中国农业科学院北京畜牧兽医研究所金迪、刘思佳、李旦、朱雅新等研究生的帮助。

朱雅新，东秀珠，黄力，董志扬. (2007). 瘤胃元基因组BAC文库研究.中国农业科技导报 009(005): 53-57.

李旦，王加启，卜登攀，刘开朗，李发弟. (2009). 荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析. 微生物学杂志 29(06): 1-4.

参考文献

1.Farrar, K. and Donnison, I. S. (2007). Construction and screening of BAC libraries made from Brachypodium genomic DNA. Nat Protoc 2: 1661-74.

2.朱雅新，东秀珠，黄力，董志扬. (2007). 瘤胃元基因组BAC文库研究.中国农业科技导报 009(005): 53-57.

3.李旦，王加启，卜登攀，刘开朗，李发弟. (2009). 荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析. 微生物学杂志 29(06): 1-4.

猜你喜欢

10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature Cell专刊 肠道指挥大脑

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人

一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树

必备技能：提问 搜索  Endnote

文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical

扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图

16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun

在线工具：16S预测培养基 生信绘图

科研经验：云笔记  云协作 公众号

编程模板: Shell  R Perl

生物科普:  肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。PI请明示身份，另有海内外微生物相关PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

点击阅读原文下载PDF审稿，或浏览器直接访问下载链接：http://210.75.224.110/github/MicrobiomeProtocol/04Review/210510/2103997ShengguoZhao980301/Protocol2103997revision.pdf