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基于DNA宏条形码的水体浮游细菌群落测序建库方法

Library construction for DNA metabarcoding of bacterioplankton communities in waters

肖鹏¹，续子杰^{1, 2}，杨军^{1, *}

¹水生态健康研究组，城市环境与健康重点实验室，福建省流域生态重点实验室，中国科学院城市环境研究所，厦门，福建；²中国科学院大学，北京

*通讯作者邮箱:jyang@iue.ac.cn

摘要: 浮游细菌是水生态系统的重要组成部分，利用DNA分子手段可对水体环境样品中的浮游细菌种类、丰度、多样性与群落组成进行检测。本方法基于水体环境样品的总基因组DNA，或者提取总RNA后逆转录的cDNA，选择合适的标记基因（主要是16S rRNA基因的可变区）进行PCR扩增，将扩增产物构建测序文库，最后利用Illumina高通量测序技术进行测序的方法。该方法可以快速、高效、大量地获取水体环境中浮游细菌的标记基因序列，后续再通过比对数据库，确定这些序列对应的分类单元信息，进而进行浮游细菌群落分析。

关键词: 水体环境，浮游细菌，群落组成，建库，高通量测序

材料与试剂

1.DNA提取试剂盒 (MP Biomedicals, FastDNA Spin Kit)

2.高保真PCR酶试剂 (New England Biolabs, Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)

3.96孔板和封板膜 (Roche, LightCycler 480 Multiwell Plate 96)

4.电泳上样缓冲液Loading buffer (Takara, 6×Loading Buffer, Cat. No. 9156)

5.琼脂糖粉末 (Sigma, A9539-250G)

6.TAE溶液 (Solarbio, 50×TAE)

7.DNA Marker (New England Biolabs, 50bp DNA Ladder, NEB #B7025)

8.凝胶纯化试剂盒 (南京诺唯赞, DC301-01)

9.Qubit分子定量试剂盒 (Promega, QuantiFlour dsDNA System)

仪器设备

1.移液器 (Eppendorf, 100–1000 μL, 10–100 μL 20–200 μL, 2–20 μL, 0.5–10 μL, 0.1–2.5 μL)

2.均质仪 (杭州奥盛, Bioprep-24)

3.离心机 (Eppendorf, 5417R)

4.干式加热器 (Labnet, D1100-230V)

5.超净工作台 (苏净安泰, Airtech)

6.漩涡混合器 (海门其林贝尔, Vortex-6)

7.200 μL八联移液器 (Brand, 10-200 μL)

8.96孔板离心机 (杭州奥盛, Mini-P25)

9.PCR热循环仪 (Bio-Rad, S1000)

10.电泳仪 (北京六一, DYY6C)

11.电泳槽 (北京六一, JYCP31DN)

12.凝胶成像仪 (上海培清, JS-680B)

13.核酸测定仪 (ThermoFisher, Qubit 4.0)

14.其他 (移液器吸头、离心管)

实验步骤

1.水体环境样品DNA提取

1.1将超净工作台用75%酒精擦拭干净，再使用紫外灯灭菌20分钟，将小剪刀和镊子放在酒精灯上反复灼烧灭菌后冷却至室温，用镊子夹住滤膜（提前过滤富集好浮游细菌），使用剪刀将载有浮游细菌的滤膜剪成小碎片后，全部装入DNA提取试剂盒的细胞破碎管中。严格参考DNA提取试剂盒中的步骤进行滤膜全基因组DNA提取（中间会使用均质仪）。材料与试剂中的DNA提取试剂盒供参考，也可使用其他品牌的试剂盒。

1.2使用60 μL的无菌TE溶液对DNA进行洗脱，提取的DNA样品浓度用超微量紫外分光光度计测定其含量和纯度，然后将提取的DNA置于-80 ^oC冰箱保存。注意：装DNA的离心管必须仔细标记样品ID、滤膜粒径、过滤水样体积和采集时间，每条信息至少标记两遍。

2.浮游细菌的PCR扩增

2.1将提取好的环境样品DNA（细菌DNA）进行分组建库，30个样品建一个库，提前记录在实验记录本上。

2.2根据自己的实验需要，选择合适的16S rRNA基因通用引物，本文中以常用的16S rDNA V3–V4引物341F和806R为例进行介绍。预先合成带有barcode信息的引物序列。其中6 bp长的barcode序列分布在两条引物的5’端。本研究中一共需要6条带不同barcode的正向引物和6条带不同barcode的反向引物，具体的barcode序列见表1。

表1. 浮游细菌群落建库测序中所用的引物序列信息，以16S rRNA基因V3–V4可变区为例

引物名称	Barcode序列	引物序列
341F_B1	ACAGTG	CCTAYGGGRBGCASCAG
341F_B2	ATCACG	CCTAYGGGRBGCASCAG
341F_B3	CGATGT	CCTAYGGGRBGCASCAG
341F_B4	GCCAAT	CCTAYGGGRBGCASCAG
341F_B5	TGACCA	CCTAYGGGRBGCASCAG
341F_B6	TTAGGC	CCTAYGGGRBGCASCAG
806R_B1	CAGATC	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
806R_B2	GATCAG	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
806R_B3	AGTTCC	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
806R_B4	GTAGAG	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
806R_B5	ATGAGC	GGACTACNVGGGTWTCTAAT
806R_B6	CACGAT	GGACTACNVGGGTWTCTAAT

2.3先将合成好的引物放入离心机中，14000 g离心3分钟，在超净工作台中将PCR引物用无菌去离子水稀释到10 μM的浓度（超净台应提前按步骤1中的方法灭菌），使用1.5 mL无菌离心管，将正反引物分别取30 μL混合在一起，并将混合好的引物对编号。具体编号原则见表2，由于本研究中一个库仅包括30个样品，这里仅混合前30对引物，后6对引物备用。

表2. 不同组合引物对的编号

引物对编号	引物组合	引物对编号	引物组合
16S1	341F_B1+806R_B1	16S19	341F_B4+806R_B1
16S2	341F_B1+806R_B2	16S20	341F_B4+806R_B2
16S3	341F_B1+806R_B3	16S21	341F_B4+806R_B3
16S4	341F_B1+806R_B4	16S22	341F_B4+806R_B4
16S5	341F_B1+806R_B5	16S23	341F_B4+806R_B5
16S6	341F_B1+806R_B6	16S24	341F_B4+806R_B6
16S7	341F_B2+806R_B1	16S25	341F_B5+806R_B1
16S8	341F_B2+806R_B2	16S26	341F_B5+806R_B2
16S9	341F_B2+806R_B3	16S27	341F_B5+806R_B3
16S10	341F_B2+806R_B4	16S28	341F_B5+806R_B4
16S11	341F_B2+806R_B5	16S29	341F_B5+806R_B5
16S12	341F_B2+806R_B6	16S30	341F_B5+806R_B6
16S13	341F_B3+806R_B1	16S31	341F_B6+806R_B1
16S14	341F_B3+806R_B2	16S32	341F_B6+806R_B2
16S15	341F_B3+806R_B3	16S33	341F_B6+806R_B3
16S16	341F_B3+806R_B4	16S34	341F_B6+806R_B4
16S17	341F_B3+806R_B5	16S35	341F_B6+806R_B5
16S18	341F_B3+806R_B6	16S36	341F_B6+806R_B6

2.4在超净工作台中配制PCR反应试剂，按PCR高保真酶的要求，加入适量的酶、缓冲液、dNTP、和无菌去离子水，反应试剂总量按100个反应量配制，先不加引物和DNA模板，使用漩涡震荡仪进行混匀后，14000 g离心2分钟。

2.5在超净工作台中取出无菌的96孔PCR板，放入合适的96孔板冰盒中，在96孔板的第1列、第4列、第7列和第10列的每个孔中分别加入54 μL上述步骤配制好的PCR反应试剂。

2.6在超净工作台中分别将步骤2.3中混合好的30对引物依次加入到96孔板中，每个引物对加入3 μL，具体加入的位置见图1。其中NG代表阴性对照，任选6对引物对，6个孔中每个孔加入1 μL，并在实验记录本上做好记录，下一次PCR时更换没测试过的6对阴性引物对。

图1. 30对引物加入的位置图（其中数字序号1–30代表第1到第30组混合引物）

2.7在超净工作台中将2.1中提前分组的30个样品DNA模板分别加入96孔板序号1–30的孔中，每个孔中加入3 μL，注意NG孔中不要加入任何DNA模板。

2.8在超净工作台中使用200 μL八联移液器，量程设置为50 μL，选择“mix”模式，分别对96孔板中第1列、第4列、第7列和第10列（前6个孔）进行吹打混匀，吹打次数不少于10次，将移液器吸头放到液面以下，尽量避免生成气泡。用八联移液器分别从第1列、第4列、第7列和第10列（前6个孔）中吸取20 μL反应液到第2–3列、第5–6列、第8–9列和第11–12列，贴上96孔板封板膜，用硬纸片将封板膜与96孔板压紧，贴牢，再使用96孔板离心机离心5分钟。

2.9将离心后的96孔板放入PCR仪中，设置反应条件进行PCR扩增。PCR条件主要依据所使用的Taq酶、产物长度、引物退火温度以及DNA模板浓度来决定。本示例中的PCR反应条件为：95 ^oC 5分钟后，进行25–30个循环（循环数依据DNA模板的浓度来决定，不宜超过30次，防止非特异性扩增）。包括95 ^oC变性30秒、55 ^oC退火30秒和72 ^oC延伸30秒，最后再72 ^oC延伸5分钟后降温到4 ^oC，PCR反应完成。

3.PCR结果电泳检测

3.1将PCR反应后的96孔板使用96孔板离心机离心5分钟，去掉封板膜。

3.2使用八联移液器，分别将第2–3列、第5–6列、第8–9列和第11–12（前6排孔）的样品分别转移回第1列、第4列、第7列和第10列（前6个孔）中。

3.3分别往96孔板第1列、第4列、第7列和第10列（前6个孔）中加入10 μL的loading buffer染料，分别混合均匀。最后6个阴性对照孔中分别加入4 μL的loading buffer，分别混合均匀。

3.4使用1×TAE溶液和琼脂糖粉末，配置2%质量体积比的琼脂糖凝胶，配置时，初始TAE溶液可以适量加多一点，防止微波加热蒸发损失。例如，2.8 g琼脂糖粉末加入到150 mL 1×TAE溶液中，混合均匀后，微波炉中火加热10分钟，待琼脂糖完全溶化后加入10 μL电泳染料，选择合适的制胶梳子制作成琼脂糖凝胶，确保凝胶中每个孔至少可以容纳50 μL PCR产物。

3.5待琼脂糖凝胶完成凝固后，将其放置于装有1×TAE溶液的电泳槽中，凝胶需要完全浸泡在TAE溶液中。分别将50 μL加好loading buffer的PCR产物加入凝胶孔中，每加好一个样品要间隔一个孔，凝胶上每一排最后一个孔需要加入10 μL的DNA Marker。最后将6个阴性对照样品全部加入凝胶孔中，每个对照之间要间隔一个孔。选择80 V、100 mA的电泳条件电泳30分钟。

3.6将电泳完毕的凝胶放置于凝胶成像仪中，调整光圈和焦距以及凝胶的位置，检查6个阴性对照中是否存在目标条带，若任一阴性样品有条带则丢弃凝胶，必须分析细菌污染原因、回顾实验过程，优化改进后重新进行PCR。若6个阴性样品全都没有条带，再基于DNA Marker检查30个样品的PCR产物是否有目标条带，如果全部30个样品都有单一、清晰的目标条带，则继续后续实验；若有部分样品无条带或有杂带则该样品需要重新PCR。

4.PCR目标条带回收纯化

4.1用75%酒精棉球擦拭切胶刀片后，在凝胶成像仪中将30个样品的目标条带小心地切下来，每切完一个样品要重新用棉球擦拭，放置于2 mL无菌离心管中。

4.2严格按照“凝胶纯化试剂盒”参考手册中的步骤进行凝胶纯化，最终纯化DNA的洗脱体积为20 μL，在最终的离心管上写明样品编号信息，做好双重标记，放置于-80 ^oC冰箱保存或直接进行后续浓度测定。

5.纯化DNA浓度测定及混库

5.1按照Qubit分子定量试剂盒参考手册中的步骤进行染料配制，一个样品需要配制染料溶液200 μL，一般按样品总需求量的110%比例配制。

5.2将200 μl配制好的染料加入到650 μL的小离心管中，离心管盖和管壁上都标上相应的样品编号，在相应的离心管中加入2 μL纯化好的PCR产物DNA，漩涡震荡混匀后，10000 g离心2分钟。

5.3将Qubit分子定量试剂盒中100 ng/μL的DNA标准品用无菌去离子水稀释到50、25、10和5 ng/μL，再分别将2 μL稀释好的DNA标准品加入不同的200 μL染料工作液中。Qubit核酸测定仪的DNA浓度标曲是两点定标法，即只需要加入1个空白（不加DNA的染料工作液）和1个最高浓度标准品，由于不确定样品纯化后的DNA浓度，所以可以先用50 ng/μL浓度标准品做标曲，随机测定几个样品，根据结果调整高浓度标曲的浓度再重新做标曲。

5.4测定完一个库的30个样品的DNA浓度之后，计算最高浓度和最低浓度之间的差异倍数，若差异倍数小于10，则进行后续混库；若差异倍数大于10，需要将相应低浓度的样品重新进行PCR扩增与纯化后，再定量。混库标准为：每个样品的DNA总量=最低浓度样品的DNA浓度×其样品体积（按14 μL算）。然后浓度最低样品的混库体积为14 μL，剩余样品的混库体积为DNA总量÷样品的DNA浓度，将所有样品按上述计算的体积加入到一个新的无菌1.5 mL离心管中，在离心管盖和离心管壁上做好双重标记。

6.DNA测序策略

6.1根据PCR产物（目标DNA片段）的大小，选择合适的测序策略进行高通量测序。如果DNA片段全长小于280 bp，建议选用二代Illumina PE150测序，如果DNA片段大于280 bp、小于480 bp，建议选用二代Illumina PE250测序，如果DNA片段大于480 bp小于580 bp，建议选用二代Illumina PE300测序，如果PCR产物大小580 bp，建议选用三代PacBio测序。

致谢

本研究获得国家自然科学基金（91851104，31672312）以及科技部国家科技基础资源调查专项（2017FY100300）的资助。

参考文献

1.Liu, M., Liu, L. M., Chen, H. H. Yu, Z., Yang, J. R., Xue, Y. Y., Huang, B. Q. and Yang, J. (2019). Community dynamics of free-living and particle-attached bacteria following a reservoir. Microcystis bloom. Sci Total Environ 660: 501–511.

2.Liu, L. M., Yang, J., Yu, Z. and Wilkinson, D. M. (2015). The biogeography of abundant and rare bacterioplankton in the lakes and reservoirs of China. ISME J 9: 2068–2077.

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