原标题：生信实操|一个生信素人的上道经验分享-转录组测序(可变剪接篇)

转录组测序技术(RNA-seq)作为目前二代测序领域最普遍的技术手段，自从转录组测序问世以来，已经开发了数百种分析工具。根据转录组分析内容可大致将其分析流程分为比对，转录本组装，差异表达分析和差异基因注释。目前，分析的每一步都有很多软件，其软件的性能和分析效率不尽相同。

对于转录组分析的第六步——绘图，主要介绍转录组分析中常见的图形绘制。下面小编来介绍转录组分析的第七步——可变剪接吧~可变剪接是指mRNA前体会通过不同的剪接方式产生不同的转录本，而不同的转录本会生成不同蛋白质进而影响生物学功能。可变剪接主要分为五种类型，分别为：外显子跳跃、5‘端可变剪接，3’端可变剪接，外显子互斥和内含子滞留。

目前分析可变剪接的软件有Asprofile，MISO，leafcutter和SpliceGrapher等。本文主要介绍SpliceGrapher的使用方法。

一、 软件介绍

SpliceGrapher是一个python包，主要使用RNA-seq数据创建剪接图。SpliceGrapher以基因模型和RNA-seq数据比对结果作为输入，预测的剪接图作为输出。SpliceGrapher可以在Linux和Mac OSX下的命令行上运行(http://splicegrapher.sourceforge.net/)。

二、 软件安装

下载：

使用下方链接下载SpliceGrapher。

https://sourceforge.net/projects/splicegrapher/

解压：

安装：

安装成功：

三、 软件使用

SpliceGrapher的使用主要分为四步：

1. 创建剪接位点的模型文件

主要通过以下步骤创建剪接位点的分类器，分别为：为剪接位点生成训练集，为每个剪接位点的分类器选择最佳参数，创建结果文件，用于鉴定剪接位点。

生成模型文件为classifiers.zip。

2. 过滤比对结果文件

本步主要使用步骤一生成的模型文件和比对文件，格式为SAM文件。若待分析物种为常见物种，则可在SpliceGrapher软件classifiers文件中自带的模型文件。使用sam_filter.py过滤比对结果。

3. 预测可变剪接

本步骤是SpliceGrapher的预测模块。本步使用步骤二生成的过滤后的SAM文件和cfg文件。

本步骤可预测指定基因的可变剪接也可预测整个基因组的可变剪接，具体操作如下：

预测单基因可变剪接时，生成的结果文件为*.gff。生成文件内容如下：

预测整个基因组可变剪接时，生成指定前缀的文件夹，文件夹内包含多个子文件夹，以染色体编号命名，每个子文件夹内包含该染色体中发生可变剪接的各个基因的gff文件。其文件夹格式如下：

|--predicted

|---chr*

|-----*.gff

4. 对可变剪接绘图

本步骤是SpliceGrapher的绘图模块，主要用于可视化可变剪接情况。本步使用步骤三生成的gff文件。

生成结果图片如下：

经验总结

SpliceGrapher软件是由多个python脚本组成的，所需python版本为2.5以上，建议小伙伴使用SpliceGrapher软件的脚本时使用python2进行调用。在运行步骤一构建分类模型时，需要安装PyML模块，具体安装方法可参考http://pyml.sourceforge.net/tutorial.html。在运行步骤二时，输入文件为SAM格式，如需使用BAM文件，可使用samtools软件将BAM文件转为SAM文件即可。除了本文介绍的功能外，SpliceGrapher还有很多其他功能，具体使用方法可参考http://splicegrapher.sourceforge.net/userguide.html。至此，转录本分析的第七步——可变剪接预测的操作过程就介绍完了，希望对大家有所帮助。请小伙伴们期待下一期 生信素人的上道经验分享吧~

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