前文回顾

1. GATK官方教程 / 概述及工作前的布置

2. GATK教程 / 体细胞短变异检测 (SNV+InDel)流程概览

3. GATK教程 / 变异检测前的数据预处理

4. GATK / 体细胞短变异检测工具Mutect2的使用

Mutect2 - 有或没有正常样本配对时，肿瘤体细胞变异检测结果对比

Mutect2 - somatic variant calling with/without matched normal sample

HaplotypeCaller is designed to call germline variants, while Mutect2 is designed to call somatic variants.

案 例

a) 使用的GATK版本

    v4.1.4.1

b) 使用了准确的GATK命令

  Matching normal

gatk Mutect2 -R hg38.fa \

-I input_tumor.bam -I input_normal.bam \

-tumor tumor_sample -normal normal_sample \

-pon gatk4_mutect2_4136_pon.vcf.gz \

--germline-resource af-only-gnomad.hg38.vcf.gz \

--af-of-alleles-not-in-resource 0.0000025 \

-L exome_autoXYM.intervals \

-O mt2_matched.vcf.gz

  No matching normal

gatk Mutect2 -R hg38.fa \

-I input_tumor.bam \

-pon gatk4_mutect2_4136_pon.vcf.gz \

--germline-resource af-only-gnomad.hg38.vcf.gz \

--af-of-alleles-not-in-resource 0.0000025 \

--genotype-germline-sites \

-L exome_autoXYM.intervals \

-O mt2_unmatched.vcf.gz

  后跟 FilterMutectCalls

gatk FilterMutectCalls -R hg38.fa \

-V {input.vcf} \

-O {output.fv_vcf}

依赖项

· 间隔/Interval文件使用bedtools(merge)创建，来自RefGene.txt.tar.gz(UCSC)

· 使用了“Genomic Data Commons(GDC)”的参考基因组和PoN

GDC参考基因组文件

https://gdc.cancer.gov/about-data/gdc-data-processing/gdc-reference-files

GDC Panel of Normal(PON)文件

此PoN文件受控，需要DBGAP访问权限才能下载，且需要使用GDC客户端下载这些内容

GDC DNA-Seq/Tumor only variant calling workflow

https://docs.gdc.cancer.gov/Data/Bioinformatics_Pipelines/DNA_Seq_Variant_Calling_Pipeline/#tumor-only-variant-calling-workflow

· 其余依赖项来自GATK

问题描述

使用基因组数据共享(Genomic Data Commons, GDC)上可用的测序数据，对Mutect2进行了匹配/不匹配正常样本的测试(Mutect2 with/without matched normal sample)。使用上面的命令，用两种不同的方法检测变异，并进行比较，看看它们重叠的程度如何。

为了做到这一点，在运行FilterMutectCalls后，过滤并获得了具有“PASS”的变异，结果看起来像这样 (对于1个肿瘤患者)：

可以看到重叠非常低(每组约20~25%)。这个结果还是很令人担忧的，因为样本均来自同一个肿瘤患者的同一次测序结果。只是：左侧有癌旁(或血液白细胞)测序对照(Matched)；右侧只测序了肿瘤组织(Unmatched)。

因为我将使用来自只有肿瘤样本的变异检测流程(Tumor-only variant calling pipeline)的数据。即只对肿瘤样本测序，没有正常样本测序，更没有肿瘤病人自身的正常组织配对样本。

有正常样本的匹配时，官方推荐的标准流程如下：

每个肿瘤病人都有自身配对的癌旁或血液白细胞测序，以尽可能地获取与肿瘤有关的突变

过滤掉病人自身存在的良性的、遗传的、等其它与肿瘤无关的变异

此类问题(无Normal配对的Tumour测序)可能没有明确的解决方案，因为有1个匹配的正常样本(A matched normal sample)才是被官方推荐的方法。

问题是：当一个病人只有肿瘤样本测序可用时(未对该病人的癌旁或血细胞测序)，是否有任何额外的过滤(Filtering)技术可以用来减少结果中假阳性(False positives)突变的数量?

问题的讨论

GATK团队：

GATK支持团队专注于解决工具产生的与GATK工具相关的错误和异常结果的问题。对于所有其它问题，比如这个问题，我们正在构建一个待办事项列表，等我们有能力的时候来解决。请继续发布您的问题，因为我们将挖掘它们以改进文档、资源和工具。我们不能保证得到回复，但是，如果你知道答案，我们会请求其它社区成员帮助。了解详情，请查看我们的支持政策：https://broadinstitute.zendesk.com/hc/en-us/articles/360038469272-What-types-of-questions-will-the-GATK-frontline-team-answer-

David Benjamin：

GDC PoN是如何生成的，其中有多少样本?

作者：

你好大卫，抱歉一直拿我的问题打扰你。我之前和GDC的人讨论过，他们用4000+血液正常样本用GATK4 (v4.0.4.0)创建PoN。

关于他们目前的管道的一些信息可以在这里找到：

https://docs.gdc.cancer.gov/Data/Bioinformatics_Pipelines/DNA_Seq_Variant_Calling_Pipeline/#tumor-only-variant-calling-workflow

GDC Panel of Normal (PON) Files used for Variant Calling (gatk4_mutect2_4136_pon.vcf.tar，文件受控制，可能需要dbGAP访问权限才能下载。也需要使用GDC客户端下载)，信息来源：

https://gdc.cancer.gov/about-data/gdc-data-processing/gdc-reference-files

另外，我只关注乳腺癌，所以我想知道是否应该只纳入PoN上的女性。

如果有人想知道其它样本是否也是如此，我已经尝试了一些其它匹配的数据，并看到了类似的数字(10-15% overlap between tumor-only and matched normal/tumor workflow)。

我还使用HaplotypeCaller确认了非匹配肿瘤分析流程所特有的变异(Variants unique to unmatched tumor-only workflow)不是胚系变异。下面是我用于胚系变异检测(Germline calling)的命令(仅为了测试任何潜在的胚系变异，不做任何过滤)：

gatk --java-options HaplotypeCaller -R hg38.fa -I normal.bam -O normal.vcf.gz

David Benjamin：

老实说，你所能希望实现的最好的Tumor-only calling是一组候选变异(A set of candidate variants)，其中大部分实际上是胚系变异(即与参考基因组不同的、生来就有的变异，与后天产生的肿瘤体细胞变异无关)。即使你极其保守，不计频率地移除gnomAD中的每1个等位基因(Removed every allele in gnomAD regardless of frequency)，仍然会留下数万个独特的胚系变异。

在Low-VAF (Variant allele frequencies)亚克隆和混入大量正常(即非肿瘤细胞)DNA的不纯样本的情况下(这个在临床上几乎无法避免：穿刺活检等方法取出来的组织会存在大量的非肿瘤细胞)，你想要的变异的等位基因分数(Allele fraction)与1/2的二倍体杂合(Diploid het)的分数显著不同，FilterMutectCalls可以做得更好(但在胚系变异的检测结果中，也存在着大量偏离50%的分数)。然而，总的来说，Tumor-only calling和Matched normal calling之间的重叠度小，是不可避免的。

罕见的胚系变异，是(有或无Normal配对的)差异的一个来源。它们并不一定会导致Tumor-only calls通过Matched normal来实现过滤。更常见的情况是，罕见的胚系变异的存在，迫使FilterMutectCalls变得保守(Conservative)，并过分地过滤了等位基因分数(或比例)接近1/2的真正的体细胞变异(如此高频的体细胞突变可能非常重要)。因为杂合子的胚系/遗传变异的等位基因分数的理论值也是1/2。区别只是在细胞内与细胞间，即：等位基因分数接近1/2的体细胞变异，在一部分细胞中完全是野生纯合子；而胚系/遗传变异的杂合子在所有细胞均为杂合。因此，Bulk DNA-seq无法区分上述两种情况。可能只有单细胞DNA-Seq测序技术可以完成所谓的“Tumor-only calling”(不必采样癌旁或血细胞来Match)，这是由体细胞突变的特点所决定的，即一部分细胞正常、一部分细胞突变，单细胞测序恰好可以观察不同细胞中的情况，而胚系突变在身体所有细胞中的情况理论上完全一致。

(有或无Normal配对的)差异的另一个来源，此差异总是导致在Normal(或在HaplotypeCaller的输出中显示的)中不存在的Tumor-only calls，(差异的来源)是可以从Matched normal中检测到的Mapping artifacts。其基本思想是，差异的基因组具有不同的结构变异(SVs)和其它影响(基因组)比对错误(Mapping error)的变异。例如，在着丝粒参考序列间隙(Centromere reference gap)中的一个SNP可能会使“天平”偏向于基因组其它地方的一个比对错误。在某种程度上，导致这一现象的变异是常见的，一个PoN可以并且确实有助于(解决)这类问题，但若有足够多的罕见变异，这就还不够。

我突然想到，尽管我们从未尝试过，但使用父系和母系样本作为两个匹配的正常样本(Mutect2可以通过指定-I表示肿瘤和两个正常样本，以及指定-normal表示两个正常样本来做到这一点)可能会有很大帮助。当然，如果你没有一个Matched normal，也就可能没有来自其父母的正常样本。

这个PoN听起来不错，我觉得没有理由排除男性(研究乳腺癌时)。

vctrymao：

你说你在Mutect2 tumor-only calling特有的变异中没有看到胚系突变？我很好奇，你是怎么运行HaplotypeCaller的？以我的理解，用HaplotypeCaller很难捕捉到罕见/独特的胚系事件(我想应该叫单例/Singletons吧？)，因为它的后续GenotypeGVCFs使用多个样本中的胚系突变来提升可信度。

David，你说“罕见的种系变异的存在迫使FilterMutectCalls变得保守，并且过度地过滤了等位基因比例接近1/2的真实体细胞变异”。Mutect2如何首先检测到这些罕见的胚系变异，从而知道要过度过滤?

你介意再详细解释一下映比对错误(Mapping error)吗？以及PoN是如何装配和使用的。

David Benjamin：

Mutect2检测罕见的胚系变异的方式，和检测其它变异的方式一样。关键是，它们非常罕见，甚至在gnomAD中都没有，所以没有任何先验知识(Prior knowledge)表明它们是胚系。(是的，gnomAD并没有完整地收录所有个体的、所有可能会发生的胚系变异；胚系变异完全不断地、随机地发生，3千万个外显子位点的、所有可能的SNP至少有9千万种，而对于InDel的数量更是无法估计)

比对错误(Mapping error)是指：将基因组的一个部位的Reads，对比到了基因组的另一个位置(这可能是由于参考序列不完整、结构变异和同源性造成的)。因为它们是真正的DNA序列，你不能用从测序和样品制备中检测错误的方式，来检测它们。我们可以寻找一些特征(Signatures)，但一组正常样本(A panel of normals)也很有帮助，因为(从一个人到另一个人)这些错误往往发生在相同的地方。

vctrymao：

我明白了。我以为gnomAD只在FilterMutectCalls中用于胚系过滤器作为先验/Prior？我还以为，如果在人群数据库中没有找到候选变异，就有方法来估计先验？

你也说过，“它们并不一定会导致Tumor-only calls通过Matched normal来实现过滤”。我有点糊涂了，你是说这些罕见的胚系事件不能用匹配的正常样本来过滤掉吗？你是说，一般来说，Mutect2即使有匹配的正常样本，也需要有人群数据库Prior才能过滤掉胚系事件吗？

如果你能详细说明Mutect2 +过滤器/Filters中的哪个统计模型中的哪些参数受到了影响，那将非常有帮助，因为我也在试图理解其中的方法论。

作者：

嘿，vctrymao，除了我在评论中提到的HaplotypeCaller命令，其它都没有运行。就像你说的，一般建议(GATK最佳实践)将多个样本一起运行，作为胚系变异检测流程的一部分。然而，为了解决我当时的问题，我决定对少量样本单独运行HaplotypeCaller，不进行任何过滤，以保留所有变异。

对于你的问题关于人群(数据库)资源的使用，对过滤胚系事件，我想指的是下面的链接下部分的“A variant allele in the case sample is not called if the site is variant in controls”/“如果某个位点在对照/Controls中变异，将不会从疾病/Case样本中调用/Call该变异的等位基因”(在底部)将有帮助：https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890491-Somatic-calling-is-NOT-simply-a-difference-between-two-callsets#:~:text=HaplotypeCaller%20is%20designed%20to%20call,designed%20to%20call%20somatic%20variants.

如果你决定进行任何与这篇文章相关的测试，请务必更新!

David Benjamin：

vctrymao，你是对的，来自胚系(变异数据库)资源的等位基因频率被用作Prior。

如果一个变异不在胚系(变异数据库)资源/Germline resource中，我们会指定一个比“1/(胚系资源的大小)”更罕见的默认等位基因频率(Allele frequency)。也就是说，如果你的10万个二倍体样本的种系资源中没有某个等位基因，我们可以猜测频率小于“1/20万”。

我所说的“它们并不一定会导致Tumor-only calls通过Matched normal来实现过滤”，我的意思是，即使在Tumor-only模式下，罕见的胚系变异有时也会被过滤掉。

Mutect2应该总是与胚系变异资源一起运行，即使是在Matched normal模式下，尽管它被设计为在没有胚系资源的情况下尽可能地运行良好。

vctrymao：

谢谢你！我想我对一些事情还很困惑。

1. 即使是在tumor-only模式下，如果罕见的胚系变异有时也会被过滤掉，这是好事，不是吗？所以问题是，罕见的胚系变异仍然没有被过滤掉？那些确实被过滤掉的胚系突变的特征是什么?

2. 你是说大多数胚系突变会在gnomAD这样的库中被捕获，所以成为大量候选胚系突变的Prior?

3. 你还说“罕见胚系变异的存在迫使FilterMutectCalls变得保守，并且过度过滤了等位基因比例接近1/2的真正的体细胞变异。”我到现在还不明白这是怎么回事。稀有胚系变异的哪一方面迫使FilterMutectCalls变得保守？在我看来，罕见的胚系变异和常见的胚系变异之间唯一的区别是人群频率Prior。但既然体细胞突变也没有人群Prior，你是说正因为如此，Mutect2把所有VAF为1/2的都称为胚系吗？

4. 在matched-normal calls而非tumor-only calls中存在哪些Calls？在什么情况下，matched-normal能够帮助识别出tumor-only caller看不到的体细胞变异?

5. HaplotypeCaller能发现罕见的胚系变异吗？我想知道你是否可以抵消我在“3)”中的观点，通过允许VAF接近1/2的体细胞变异通过过滤器，然后通过HaplotypeCaller过滤掉所有剩余的(和罕见的)胚系变异。

作者：

嘿，vctrymao，关于#4，David Benjamin在之前的评论之一中涵盖了潜在的情形：

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/community/posts/360057810051/comments/360009638892

David Benjamin：

1. 即使是在tumor-only模式下，如果罕见的胚系变异有时也会被过滤掉，这是好事，不是吗？所以问题是，罕见的胚系变异仍然没有被过滤掉？

是的；是的。

那些确实被过滤掉的胚系突变的特征是什么?

这完全取决于等位基因分数与①体细胞聚类模型确定的谱/Spectrum的匹配程度，与(Versus)②局部拷贝数给出的胚系等位基因频率的匹配程度（如果使用CalculateCondition的-tumor-segmentation输入；否则，假设每个地方的拷贝数都是2）。

2. 你是说大多数胚系突变会在gnomAD这样的库中被捕获，所以成为大量候选胚系突变的Prior?

是的，但问题是，这种罕见的胚系变异占了胚系变异的很大一部分。相反，罕见的胚系变异比体细胞变异更常见。

3. 你还说“罕见胚系变异的存在迫使FilterMutectCalls变得保守，并且过度过滤了等位基因比例接近1/2的真正的体细胞变异。”我到现在还不明白这是怎么回事。稀有胚系变异的哪一方面迫使FilterMutectCalls变得保守？

在我看来，罕见的胚系变异和常见的胚系变异之间唯一的区别是人群频率Prior。但既然体细胞突变也没有人群Prior，你是说正因为如此，Mutect2把所有VAF为1/2的都称为胚系吗？

参见#1的答案。

4. 在matched-normal calls而非tumor-only calls中存在哪些Calls？在什么情况下，matched-normal能够帮助识别出tumor-only caller看不到的体细胞变异?

1个匹配的正常样本(Matched normal)可以提供非常好的证据，证明1个变异肯定不是1个胚系变体。(A matched normal can give very good evidence that a variant is definitely not a germline variant.)

5. HaplotypeCaller能发现罕见的胚系变异吗？

绝对可以的。

  我想知道你是否可以抵消我在“3)”中的观点，通过允许VAF接近1/2的体细胞变异通过过滤器，然后通过HaplotypeCaller过滤掉所有剩余的(和罕见的)胚系变异。

你可以这样做，但我看不出这样做会有什么效果。HaplotypeCaller无法区分具有大的等位基因分数(Large allele fractions)的体细胞变异与胚系变异。

ming hu

你好，我在哪里可以下载到这个GATK中的文件, gatk4_mutect2_4136_pon.vcf.gz，能给我一个链接吗？谢谢

资料来源

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/community/posts/360057810051-Mutect2-somatic-variant-calling-with-without-matched-normal-sample

(GATK/社区/体细胞)

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/community/topics/360001488872-Somatic

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