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VarScan 简介
VarScan 安装和使用说明：安装、说明、配置、运行
VarScan 案例实战：数据下载、配置、运行、输出
使用sixbox快速运行

hello，大家好，今天为大家带来关于肿瘤体细胞突变检测工具VarScan的超详细安装及应用教程。

我们将持续为大家带来生物医疗健康大数据分析的一文详解系列文章，欢迎大家关注并星标我们，可以更及时的看到我们的文章哦。

VarScan简介

VarScan是一个java写的linux系统下进行肿瘤体细胞突变检测（calls SNV in somatic variants）的软件，可用于目标捕获（targeted），外显子（ exome）以及全基因组测序（whole-genome resequencing）等多种测序数据。

插一句：体细胞突变（somatic mutation）是指患者某些组织或者器官后天性地发生了体细胞变异，虽然它不会遗传给后代个体，却可以通过细胞分裂，遗传给子代细胞。体细胞突变对肿瘤的发生发展有关键性的作用，并且它也是制定肿瘤癌症靶向治疗措施的关键所在。

VARSCAN有3个功能，如下图：

比较常用的是肿瘤样本——正常样本配对somatic mutation模式。

安装说明

2.1. 安装

VarScan寄存在sourceforge网站[1]，可通过链接：https://sourceforge.net/projects/varscan/files/

下载java二进制文件：

wget --no-check-certificate https://nchc.dl.sourceforge.net/project/varscan/VarScan.v2.3.9.jar

这里我们指定--no-check-certificate 允许chc.dl.sourceforge.net的过期证书。

终端运行：

# java -jar VarScan.jar VarScan v2.3 USAGE: java -jar VarScan.jar [COMMAND] [OPTIONS] COMMANDS: pileup2snp Identify SNPs from a pileup file pileup2indel Identify indels a pileup file pileup2cns Call consensus and variants from a pileup file mpileup2snp Identify SNPs from an mpileup file mpileup2indel Identify indels an mpileup file mpileup2cns Call consensus and variants from an mpileup file somatic Call germline/somatic variants from tumor-normal pileups copynumber Determine relative tumor copy number from tumor-normal pileups readcounts Obtain read counts for a list of variants from a pileup file filter Filter SNPs by coverage, frequency, p-value, etc. somaticFilter Filter somatic variants for clusters/indels fpfilter Apply the false-positive filter processSomatic Isolate Germline/LOH/Somatic calls from output copyCaller GC-adjust and process copy number changes from VarScan copynumber output compare Compare two lists of positions/variants limit Restrict pileup/snps/indels to ROI positions

安装成功。

2.2 软件运行前准备工作-pileup文件

VarScan需要准备正常样本，肿瘤样本pileup文件，首先，使用samtools处理normal，tumor样本的bam文件，得到相应pileup文件。

运行命令：

samtools mpileup \ -q 1 \ -f $REFERENCE \ ${NORMAL_BAM} \ --output $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.normal.pileup samtools mpileup \ -q 1 \ -f $REFERENCE \ ${TUMOR_BAM} \ --output $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.tumor.pileup

2.3 软件运行

运行

java -Xmx10g -jar /home/6oclock/bin/VarScan.v2.3.9.jar somatic \ $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.normal.pileup \ $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.tumor.pileup \ $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.mut

输出文件：运行完会生成.snp和.indel文件，其中后缀为.snp的文件即为对应snv结果，.indel为indel结果。

实战

以NA12878样本的测序数据，具体来实践一下吧。

3.1 数据下载

下载肿瘤样本与配对的正常样本的测序bam数据：

# 网站站点 data_url=http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS # 正常样本 wget ${data_url}/NA12878.WGS.chrM.BwaMem.sort.bam # 肿瘤样本 wget ${data_url}/hg19.NA12878.tumor_addsnv.WGS.chrM.BwaMem.bam

下载比对需要的参考基因组数据及其索引文件：

# 网站站点 data_url=http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/Reference/hg19.chrM.fasta_BwaMem_index # 参考基因 wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta # 索引 wget ${data_url}/hg19.chrM.dict wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.amb wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.ann wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.bwt wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.pac wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.sa

3.2 准备pileup文件

使用samtools分别处理normal，tumor样本的bam文件，以生成相应pileup文件， shell运行：

# 处理正常样本 samtools mpileup \ -q 1 \ -f hg19.chrM.fasta \ NA12878.WGS.chrM.BwaMem.sort.bam \ --output NA12878.normal.pileup # 处理肿瘤样本 samtools mpileup \ -q 1 \ -f hg19.chrM.fasta \ hg19.NA12878.tumor_addsnv.WGS.chrM.BwaMem.bam \ --output NA12878.tumor.pileup

3.3 运行命令

此处我们将程序运行的标准输出和标准错误都分别重定向到对应的log和err文件中了。一步式运行：

java -Xmx10g -jar VarScan.v2.3.9.jar somatic \ NA12878.normal.pileup \ NA12878.tumor.pileup \ NA12878.tumor \ 1>ass.log \ 2>ass.err

3.4 输出结果

此处我们的测试案例数据做了截取，因此可以非常快速的跑完，具体的结果如下图所示，可以看到生成了NA12878.tumor.snp 和NA12878.tumor.indel文件。其中NA12878.tumor.snp 即为最终检测出的肿瘤SNV结果，结构如下所示：

输出结果中几个比较重要的列的解释：

chrom ：染色体； position ：染色体坐标;

ref ：参考基因该位点基因型。

var ：变异位点的基因型;

normal_gt：正常样本该位点基因型;

tumor_gt：肿瘤样本该位点基因型;

somatic_status : 该变异的类型，一般区分为Germline和Somatic ，如上图标红部分，即为一个体细胞突变（somatic mutation）。

至此，VarScan的实战体验基本就结束了。

sixbox运行

此外，sixoclock官网[2]基于CWL (common workflow language) 对VarScan软件进行了封装，通过我们开发的sixbox 软件可以快速进行软件的运行。对sixbox不了解可以通过六点了官网[3]了解下。下面是具体的运行步骤如下。

下载cwl 源码

sixbox pull c6e4a52a-ecb4-470d-90c1-0d2fcbd42e09

运行sixbox cwls 可以看到下载成功：

下载数据

wget http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.tumor.pileup wget http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.normal.pileup

参数配置

使用sixbox生成参数模板文件(YAML) , 并配置yaml文件

sixbox run --make-template 6oclock/VarScan-Somatic:v2.3.9 > varscan.job.yaml vim varscan.job.yaml # 编辑参数配置文件，替换或设置参数以实现个性化分析

可以直接粘贴下方示例内容到varscan.job.yaml

out_file_name: NA12878_addsnv tumor_pileup: # type "File" class: File path: http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.tumor.pileup normal_pileup: # type "File" class: File path: http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.normal.pileup

使用sixbox运行

运行命令，

sixbox run 6oclock/VarScan-Somatic:v2.3.9 varscan.job.yaml

即可看到当前目录或者指定的输出目录输出对应的结果文件。运行日志如下：

{ "snp_file": { "location": "file:///home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.snp", "basename": "vanscan_somatic_out.snp", "class": "File", "checksum": "sha1$d4866a3b95da941fcd10f3543075996c75b00a6b", "size": 5620, "path": "/home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.snp" }, "indel_file": { "location": "file:///home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.indel", "basename": "vanscan_somatic_out.indel", "class": "File", "checksum": "sha1$15e45c3b0a3287b82ad7278e09a2f573c85784e3", "size": 326, "path": "/home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.indel" } } INFO Final process status is success

以上为我们给大家带来的肿瘤基因组体细胞的基本原理知识，以及在六点了平台上运行经典的VanScan的详细操作过程。如果对生物医疗健康大数据相关内容感兴趣也可以持续关注我们。

想要探索更多的软件流程或者知识文档，可以到六点了官网[2]看到。

References

[1] sourceforge网站: http://varscan.sourceforge.net/

[2] sixoclock官网: http://www.sixoclock.net

[3] 六点了官网: http://www.sixoclock.net

[4] Koboldt, D., Zhang, Q., Larson, D., Shen, D., McLellan, M., Lin, L., Miller, C., Mardis, E., Ding, L., & Wilson, R. (2012). VarScan 2: Somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing Genome Research DOI: 10.1101/gr.129684.111

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