MCE公司：DDR1 和 DDR2 双靶点抑制剂的设计合成及其抗炎作用研究

盘状结构域受体（discoidindomain receptors, DDRs）是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，包括 DDR1 和 DDR2，由胞外结构域、跨膜域和胞内激酶域三部分组成。与其它的受体蛋白酪氨酸激酶相比，该类蛋白的胞外结构域上含有一个类似于盘基网柄菌凝集素盘状结构域 1的结构，也称盘状结构域（DR 区）；其次，在 DR 区与跨膜区之间有很长的近膜区（JM区）。

DDR1 主要包括 DDR1a、DDR1b、DDR1c、DDR1d 和 DDR1e 五个亚型，亚型的不同主要是由跨膜激酶蛋白的 mRNA 选择性剪接所导致，而 DDR2 至今尚未发现其它亚型。DDRs 在人和小鼠组织中表达广泛，涉及细胞形态的形成、分化、增值、黏附、迁移和侵袭。大量的研究表明，DDR1 和 DDR2 是多种炎性细胞因子分泌的关键介质 [1-3] ，在多种炎症性疾病中失调，如动脉粥样硬化、骨关节炎、器官纤维化。胶原诱导的 DDR1b 的激活可以显著促进巨噬细胞在炎症反应过程中产生白细胞介素 8( IL-8 )、巨噬细胞炎性蛋白 1α (MIP-1α) 和单核细胞趋化蛋白 1 (MCP-1)。DDR1 敲除的小鼠可以降低脂多糖（LPS）诱导的趋化因子分泌，并使死亡率降低。小分子 DDR1 抑制剂可以减少炎性细胞因子的释放，在小鼠炎症模型中明显的治疗效果。

研究表明，DDR2 的激活可促进人树突状细胞产生 IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ) 等细胞因子，对炎症性疾病有重要作用。Ⅰ型胶原介导的 DDR2 激活对于纤维化发生至关重要，在早期酒精性肝病模型中，沉默 DDR2 的表达可减少酒精性肝损伤和纤维化。I 型胶原激活 DDR2 可以诱导原代人肺成纤维细胞中 DDR1 的表达，表明这两种受体之间可能存在串扰 [4-5]。因此，DDR1 和DDR2 双靶点抑制剂的开发可能是抗炎药物研发颇有希望的策略。目前已报道了大量的 DDR1 和 DDR2 抑制剂，但大部分化合物选择性差，因此急需寻找选择性好的 DDR1 和 DDDR2 双靶点抑制剂。

基于这一出发点，作者对课题组前期报道的 DDR1 选择性抑制剂 4（DDR1, IC50：9.7 nM; DDR2, IC50：175 nM）进行结构改造。（图1）首先，分析化合物 4 与 DDR1 蛋白、DDR2 蛋白的结合模式（图2A-2B），化合物以相似的激酶二型结合模式作用于 DDR1 和DDR2。有意思的是，化合物可以与 DDR1 的 Met704、Glu672、Asp784 残基形成四个氢键，而不能与 DDR2 蛋白中相应的 Met95 形成氢键。此外，DDR2蛋白中的空间位阻使得化合物 4 中的吡唑啉[1,5-a]嘧啶基团与 Tyr94、Met95 残基发生碰撞，进而导致其对 DDR2 的活性较弱。作者通过骨架迁跃的策略，对该基团进行替换，设计了一系列化合物，最终获得化合物 5n不仅具有双重 DDR1 和 DDR2 抑制活性，同时对 Abl1 具有较好的选择性（DDR1, IC50：9.4 nM; DDR2, IC50：20.4 nM；Abl1, IC50：494 nM），其与 DDR1 蛋白的晶体结构复合物揭示了其确切的作用模式（图3）

图1.化合物 4 的结构式及化合物的设计（图片来源：《J. Med. Chem.》）

图2 化合物 4 与 DDR1、DDR2的结合模式预测（图片来源：《J. Med. Chem.》）

图3.化合物 5n 的结构式及其与 DDR1 的共晶结合模式图（图片来源：《J. Med. Chem.》）

采用 DiscoveRx 方法测得化合物 5n 与 DDR1、DDR2 蛋白的结合常数分别为 7.9 nM 和 8.0 nM。激酶谱实验评价了化合物 5n 对 468 种激酶的影响，化合物的总体选择性较好，但对 Abl1，EPHA2， EPHA7，EPHA8，EPHB2，LCK，LOK，TIE2，TrkA，TrkB 和 TrkC 等靶点的选择性较差，结果如图 4 所示。

图4. 化合物 5n对脱靶激酶的活性（图片来源：《J. Med. Chem.》）

采用原代人肺成纤维细胞评价化合物对 DDR1 和 DDR2 蛋白活化的影响，Western 结果如图5所示，化合物可以剂量依赖性的降低 DDR1 和 DDR2 的磷酸化，且对总蛋白的量不产生影响。此外，化合物在 50 nM 和 100 nM 对 c-Abl 激酶的磷酸化均不产生影响。

图5.化合物 5n 对 DDR1 和 DDR2 磷酸化的影响
（图片来源：《J. Med. Chem.》）

由于 DDR1 和 DDR2 是多种炎性细胞因子分泌的关键介质，因此作者分别评价了化合物 5n 在体外和体内的炎症改善效果。首先，化合物 5n 可以降低原发性腹腔巨噬细胞种 LPS 诱导的 IL-6 分泌（图6）。其次，化合物可以改善 LPS 诱导的急性肺损伤小鼠模型中的炎症症状。（图7）

图6.化合物 5n 可以降低原发性腹腔巨噬细胞种 LPS 诱导的 IL-6 分泌
（图片来源：《J. Med. Chem.》）

图7. 化合物 5n可以改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中的炎症症状
（图片来源：《J. Med. Chem.》）

小M 的小思考：

近年来，人们对 DDRs 蛋白的作用机制及临床意义进行了深入的研究，证明其参与体内多种信号通路的传导和多种生理病理过程。由于其在炎症方面的重要作用，使得其成为开发抗炎药物的重要靶点。本文作者通过分析选择性DDR1 抑制剂在生物学上存在的不足，致力于开发 DDR1 和 DDR2 双靶点抑制剂，并最终获得了化合物 5n，其在体内外均具有较强的抗炎活性。这一研究为寻找强效抗炎活性的候选药物提供了新的思路。

参考文献

[1] Leitinger, B. Discoidin domain receptor functions inphysiologicaland pathological conditions. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2014, 310, 39−87.

[2] Borza, C. M.; Pozzi, A. Discoidin domain receptors in disease. Matrix Biol. 2014, 34, 185.192.

[3] Li, Y.; Lu, X.; Ren, X.; Ding, K. Small molecule discoidindomain receptorkinase inhibitors and potential medical applications. J. Med.Chem. 2015, 58, 3287−3301.

[4] Yang, J.; Wheeler, S. E.; Velikoff, M.; Kleaveland, K. R.; Lafemina,M. J.; Frank, J. A.; Chapman, H. A.; Christensen, P. J.; Kim, K. K. Activatedalveolar epithelial cells initiate fibrosis through secretion of mesenchymalproteins. Am. J. Pathol. 2013, 183, 1559−1570

[5] Luo, Z.; Liu, H.; Sun, X.; Guo, R.; Cui, R.; Ma, X.; Yan, M. RNAinterference against discoidin domain receptor 2 ameliorates alcoholic liverdisease in rats. PLoS One 2013, 8, No. e55860.

[6] Wang, Z.;Ding, K.;Lu, X et al.Design, Synthesis, and Biological Evaluation of 3 -(Imidazo[1,2.a]pyrazin-3-ylethynyl)-4-isopropyl.N.(3-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-5(trifluoromethyl)phenyl)benzamide as a Dual Inhibitor of Discoidin DomainReceptors 1 and 2. J. Med.Chem.

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