自然界中细菌通常以含有许多物种的群体形式存在，它们之间存在复杂的互作，并因此塑造了整个群落。关于它们之间互作的研究通常是体外的，由此得出的结果很难直接转移至宿主相关的体内环境，因为存在空间和营养环境的差异。在植物微生物组相关领域，目前大多的互作聚焦于病原菌侵染的患病植物中的互作，健康植物中细菌的互作以及驱动群落组装的机制依然缺乏研究。

很多互作研究利用共存网络，它是基于物种丰度相关性进行的，不能证明直接的相互作用。因此利用复杂度降低同时还具有群落代表性的合成群落（SynComs）进行体内互作研究是比较可行的方案。

瑞士苏黎世联邦理工学院微生物研究所Julia A. Vorholt研究团队在2022年5月30日发表在Nature Microbiology（IF：17.75）上的题为 Mapping phyllosphere microbiota interactions in planta to establish genotype–phenotype relationships 的论文对上述问题进行了研究。

https://doi.org/10.1038/s41564-022-01132-w

摘要

宿主相关的微生物群落中有数百种细菌共存，为多种细菌之间的相互作用创造了机会，反过来也为整体的群落结构形成做出贡献。细菌之间这种自我组织的机制在很大程度上仍然不为人知。本文对叶际微生物群中的细菌相互作用进行了研究。我们通过将200个内生菌单独添加到含15个成员的合成群落中并跟踪其在模式植物拟南芥定殖后群落组成的变化，来筛选植物中的微生物相互作用。在植物中90%为负相互作用，系统发育关系相近的菌株对合成群落产生了一致的影响，这为性状保守型提供了支持。群落变化可以很大程度由二元互作解释，但是我们也鉴定到了多于两个互作菌株的高阶互作。进一步对放线菌门的两个成员之间突出的互作进行研究发现，在气微菌属（Aeromicrobium Leaf245）存在时，类诺卡氏菌属（Nocardioides Leaf374）减少了两个数量级。我们在Aeromicrobium Leaf245中鉴定到了一个有效的抗菌肽酶，它可以导致Nocardioides Leaf374的裂解。一个相应的Leaf245突变菌株对于恢复Nocardioides在植物中的定殖是必须且充分的。这表明直接的细菌-细菌互作对原始观察到的群落变化是必要的。本研究突出了合成群落筛选的能力并揭示了空间异质性环境中强烈的微生物互作。

结果

选择并表征合成群落

作者从拟南芥叶来源的细菌库At-LSPHERE中选择了系统发育多样且代表性的高丰度15个菌株，组成了合成群落，称为中心群落（focal community）（图1）。并将At-LSPHERE中的其余200个菌株和一些选择的模式菌株对合成群落的影响逐个进行了研究。中心群落中的大多数菌株都能定殖在叶际，达到10⁷-10⁸ cfu/gFW（图1c）。按单菌株等比例混合的中心群落接种后测叶际样品的16    S 扩增子，发现Methylobacterium Leaf88, Rhizobium Leaf371 和Chryseobacterium Leaf405的相对丰度在10%以上。9个在1-10%之间，3个小于0.1%（图1d）。单菌株去除和替换实验表明中心群落非常稳定（附件）。

图1 a. 实验设计。b. 筛选的中心群落成员系统发育树。c 各个菌株在叶际定殖情况。d. 扩增子测得的中心群落各成员相对丰度。

At-LSPHERE菌株的全局性互作图谱

作者把200个At-LSPHERE菌株逐个接到中心群落，得到15+1成员。接种定殖叶际约三周后，记录它们相对于未处理的中心群落的相对丰度变化（图2a）。也做了中心群落成员自身作为外来接种菌株的处理。这些对照条件下中心群落组成无显著变化，只有Leaf427作为外来接种菌时，Leaf33减少了（log2fold change:-2.52）。总之，这些结果验证了中心群落的稳健性。

图2 a. At-LSPHERE（外圈）和中心群落（内圈）的互作图谱。红色和蓝色连线分别代表正/负相互作用，粗细代表变化倍数。最外圈的柱状图表示对中心群落的总效应值（overall effect size；PCA，PERMANOVA）。b. a中鉴定到的互作菌株成对接种变化。顶部代表中心群落在a中观察到的倍数变化，作为reference。下面是成对接种 vs. 单接种的倍数变化。R1和R2代表两次重复。c. Methylobacterium Leaf88单接种或与 Xylophilus Leaf220或Methylophilus Leaf408 双接种或三接种在叶际的定殖情况。

200个测试菌中有57个与中心群落菌株有互作，共84个互作。其中90%是负的互作，表明了它们的竞争效应。系统发育距离近的菌株对中心群落有相似的效应，大部分负相互作用发生在系统发育距离近的菌株之间（图2a）。Pseudomonas Leaf129除外，它也经常和远距离菌株互作。对于中心群落中同属内至少三个负互作的菌，作者测试了它们的互作，发现Rhizobium Leaf371, Sphingomonas Leaf67和Methylobacterium Leaf88是属内负互作的，暗示相近菌株的竞争。有趣的是，其中一些互作在之前的62个成员的合成群落中也是存在的，表明这些互作即使在更复杂的情况下也存在。

除了Aeromicrobium Leaf245外，所有具有20%以上效应值的菌都与至少两个中心菌株互作。Serratia Leaf50 有27%（最高的）效应值，与四个中心菌株互作，暗示其重塑群落的强大力量。事实上，这个菌株和植物病原菌Pseudomonassyringae pv. tomato DC3000是唯一在群落中出现时还能在某些植物引起疾病的菌（附件），这和已报道Serratia Leaf50是植物病原菌一致，且揭示了它对中心群落的强大影响。

为测试这些互作是二阶或高阶的，作者进行成对接种与单接种比较并测cfu。7/12互作可以在成对接种重现（图2b）。与单接种相比，与中心菌株负互作的Rhizobium Leaf68 和Acidovorax Leaf76、Leaf160在成对接种中没有明显变化，暗示偏害共生（amensalism）。Xanthomonas Leaf148 和 中心菌株Aeromicrobium Leaf272互作：Leaf272共接种比单接种丰度上升，Leaf148不变，表明偏利共生（commensalism）。

成对接种不能捕捉到高阶互作，作者就做了三接种。因为Xylophilus Leaf220也与Methylophilus Leaf408互作（图2a），因此Leaf220可能对Methylobacterium Leaf88和Leaf408互作是必须的。的确作者重现了Leaf88和初始筛选得到的相当比例的丰度下降（图2c）。有趣的是，Leaf220丰度无论是与Leaf408还是Leaf88共接种都会上升，暗示支持Leaf220的相似机制，可能和Leaf408、Leaf88都是甲基营养型菌株有关。

Nocardioides Leaf374 – Aeromicrobium Leaf245的互作

在体外的18个抑制性互作中，2个在体内也鉴定到（附件），其中包含Nocardioides Leaf374 (Leaf374) 和Aeromicrobium Leaf245。作者选这一对还因为Leaf374在体内有50倍丰度的下降（图2a）。作者在植物体内顺序接种它们，进一步验证此结果。发现接种顺序不重要，即使是已经定殖的Leaf374，Leaf245也能降低它的丰度（图3a）。二元验证和初始植物体内筛选的Leaf374下降程度相当。Leaf245的无细胞上清就足以抑制Leaf374（图3b），甚至还能裂解Leaf374细胞（附件）。煮沸或加入有机溶剂之后，抑制能力消失，于是作者推断抑菌活性分子是蛋白。作者把Leaf245培养上清分离得到一些有抑制活性的蛋白（图3c，d），并把它们在大肠杆菌中异源表达。在这些蛋白中，有一个推定的M23家族内肽酶（ASF05_00205）导致了抑制和裂解（图3e）。

图3 a. Leaf374单定殖或与Leaf245共定殖。b. Leaf374和Leaf245活细胞或无细胞上清的体外互作。c. 体积排阻色谱对Leaf245上清进行分级分离。d. Leaf245上清中（见c）和第二次生物学重复中观察到的蛋白SDS-PAGE。箭头是质谱鉴定到的蛋白。e 纯化的候选蛋白体外对Leaf374的抑菌活性。

为进一步证明Leaf374的抑制是由Leaf245上清中的蛋白引起的，作者进行了功能缺失突变体的构建。但是全部失败。于是作者利用化学诱变来寻找体外抑菌活性消失的突变体。筛选了经EMS诱变产生的超过10,000个克隆，鉴定到56个全部或部分抑菌活性消失的突变体。最终选择了33个保留最多2%活性的克隆进行了全基因组测序（图4a）。ASF05_00210位点在40%分析菌株中存在突变，它编码3 kb的注释为转录激活子且直接位于之前鉴定到的细菌裂解蛋白ASF05_00205上游（图4b）。ASF05_00205也在一个突变株中突变，相应的蛋白显示出对Leaf374减弱的抑菌活性。突变的蛋白不能裂解Leaf374细胞（附件）。这个重要的突变是S70L。在鉴定到的剩余的克隆，包括上面描述的，未发现其它预测的效应蛋白存在突变（附件）。作者还在两个其它的克隆中发现了潜在的调节突变。对这些克隆和ASF05_00210突变体进行上清分级分离发现它们不再能分泌ASF05_00205内肽酶（图4c）。

图4 a. Leaf245抑菌功能缺失突变体重测序。ASF05_00210 (红色) 和ASF05_00205 (黄色) 突出显示。b. 编码调节子ASF05_00210（红）和效应子（黄）的基因对在Leaf245基因组的位置。c. 野生型Leaf245中的活性蛋白和相应的EMS诱变突变体中的部分的蛋白的SDS-PAGE。d. 单接种或与野生型Leaf245或突变体共接种时，Leaf374在拟南芥的定殖。

为测试Leaf245突变体是否不再抑制Leaf374的定殖，作者把它们做了共接种实验。首先发现，Leaf245突变体单接种与其突变体有相似的定殖密度（附件），表明变化不是Leaf245定殖本身引起的。相比与野生型共接种，Leaf374在与Leaf245 ASF05_00210突变体（不能分泌 ASF05_00205 效应子）共接种时，丰度提高了20倍，与携带ASF05_00205 S70G突变的效应子分泌弱化的突变体共接种时丰度上升了10倍。这和体外抑制实验的结果一致。然而，同样不能分泌效应子 ASF05_00205 的E_12和E_48突变体则没有影响Leaf374的定殖。可能是因为在植物体内和体外有不同的调控模式。Leaf374的增加并没有影响Leaf245的定殖（附件）。

总之，Leaf374的体内定殖由推定的M23家族内肽酶ASF05_00205影响。它受ASF05_00210调节。作者把它们分别命名为Nocardioides lysis-associated peptidase (NlaP) and regulator (NlaR)。

Nlap的靶标范围和它在其它物种的普及程度

作者想探索NlaP是否在其它细菌中也存在，作者搜索了Integrated Microbial Genomes (IMG) 数据库。结果搜索到了At_LSPHERE中的Aeromicrobium种Leaf289、Leaf272 和Leaf291。在前面的筛选中鉴定到了Leaf289和Leaf374的互作（图2a）。此外还鉴定到了At-RSPHERE中的Terrabacter spp.。它们含有nlaP 和 nlaR，在基因组上相互邻近但方向相反（图5a）。

图5 a. 与ASF05_00205（nlaP，红色）相比，Leaf245和包含相似基因邻域的示范菌株的基因组区域。b. 编码nlaP和nalR同源物的候选菌株和不含nlaP的Aeromicrobium对照菌株的体外活性。c. Aeromicrobium 和Terrabacter对一系列放线菌的体外抑制。

所有的Terrabacter spp.都对Leaf374有强烈抑制作用（图5b）。作者发现缺乏nlaP的Aeromicrobium spp.（Root236, Root344 and Root495）在体外不能抑制Leaf374（图5b）。接下来作者选择了含内肽酶活性的At-LSPHEREAeromicrobium spp.和At-RSPHERE Terrabacter Root85对At-L-和At-R-SPHERE的放线菌门的菌的活性（图5c）。At-LSPHERE、At-RSPHERE和少数其它菌株的活细胞都可以抑制 Nocardioides spp.，且是密度依赖性的。无细胞上清的作用仅限 Nocardioides spp.和非常相近的Marmoricola sp. (Leaf446)。Aeromicrobium Leaf245 和Terrabacter Leaf85 的上清比其它菌株的活性更强，暗示它们分泌更多蛋白或拥有更强活性的蛋白。这也许解释了Aeromicrobium spp.和Leaf374在体内互作强度的差异。

最后作者也分析了对Leaf374有抑制作用的纯化的蛋白Nlap ASF05_05375和 ASF05_12180（图3e） 的抑菌谱。它们对Nocardioides spp.和Marmoricola sp. Leaf446都有抑制作用，证明了内肽酶依赖的对此组菌负相互作用的专一性，并为未来研究这一迄今为止研究甚少的细菌群的靶标特异性提供了基础。

通讯作者

Julia A. Vorholt，来自瑞士苏黎世联邦理工学院微生物研究所。主要研究环境如何塑造细菌生理学，重点是植物微生物群。在不同的尺度上进行功能分析，从代谢物和蛋白质水平到单个细胞、细菌群落、植物-微生物相互作用和生态系统。研究涉及一系列互补的学科和方法，包括代谢组学、（元）蛋白质组学、转录组学、显微观察、代谢工程，以及用于单细胞分析的纳米技术新工具。实验室主页：https://micro.biol.ethz.ch/research/vorholt.html

发表文章187篇，其中包含多篇CNS及其子刊文章。总被引18447次，H指数70。https://scholar.google.ch/citations?user=B2U54GAAAAAJ&hl=de

Schäfer, M., Vogel, C.M., Bortfeld-Miller, M. et al. Mapping phyllosphere microbiota interactions in planta to establish genotype–phenotype relationships. Nat Microbiol 7, 856–867 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01132-w

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