易基因 | 转录组测序在原核生物研究中的应用（4）| 文献科普

微生物在特定生境或时期中会表现出基因表达差异性，以此应对环境变化。原核转录组测序分析是专业针对原核微生物设计开展的转录组学研究。此前，易基因已推送多篇关于原核转录组研究文章：

转录组测序在原核生物研究中的应用（1）

转录组测序在原核生物研究中的应用（2）

转录组测序在原核生物研究中的应用（3）

今天要给大家分享的文献科普则是发表于NPJ Biofilms Microbiomes期刊的关于嗜水气单胞菌的原核转录组研究，一起来看看吧。

IolR是一种肌醇代谢途径的负调控因子，通过下调嗜水气单胞菌的RpmA来抑制细胞的自聚集和生物膜的形成

易点评

嗜水气单胞菌是鱼类运动性气单胞菌败血症的病原体。先前的研究表明，肌醇代谢对这种细菌的毒力是必不可少的。IolR是一种转录抑制因子，可以负向调节肌醇代谢活性。在研究嗜水气单胞菌中国流行株NJ-35的肌醇分解代谢过程中，我们偶然发现ΔIOL R突变体与野生型相比具有明显的自聚集性和生物膜形成的增加。通过不同的降解处理，证实了表面蛋白在嗜水气单胞菌自聚集中的作用。此外，钙促进聚集体的形成，而聚集体在钙螯合剂EGTA的存在下消失。转录组分析以及随后的靶基因缺失表明，iolR失活引起的生物膜形成和自身聚集是由于RTX家族黏附基因rmpA转录增加所致。进一步确定IolR可以直接调控rmpA的转录。这些结果表明，iolR与嗜水气单胞菌的自我聚集和生物膜的形成负相关，这与其抑制rmpA的表达有关。

背景

嗜水气单胞菌是一种普遍存在的革兰氏阴性细菌，可引起人类以及各种水生和陆地动物的感染。嗜水气单胞菌的发病机制是复杂的、多因素的，涉及粘附素、毒素和铁元素摄取系统等多种毒力因子。尽管不断有新的毒力因子被人们发现，但这种细菌的致病机制仍不清楚。

感染症状最基本的原理是微生物获取宿主养分。在感染期间细菌病原体在与其他微生物争夺营养的同时，经常会遇到碳、氮和能量的紧张。越来越多的研究表明，病原体已经开发出了特定的代谢策略，以提高它们在营养贫乏环境中的适应性。因此，新陈代谢在致病性研究中的作用逐渐被认为与细菌毒力一样重要。

作者前期的研究表明，嗜水气单胞菌毒力菌株具有利用肌醇(MI)、唾液酸和L-岩藻糖的3条代谢途径，其中MI代谢途径在嗜水气单胞菌NJ-35中起着相对重要的作用。许多微生物将MI代谢途径作为碳和能量的唯一来源，例如鼠伤寒沙门氏菌和嗜肺军团菌。在嗜水气单胞菌NJ-35的基因组中，肌醇的分解代谢由12个基因完成，它们分布在一个32.8kb的基因岛上(U876_07765-07910)。MI的降解是由2-脱氢酶(IolG_1/IolG_2)启动的，后续的降解还需要IolEDBCA编码的酶。MI代谢的最终结果是MI转化为磷酸二羟丙酮和乙酰辅酶A的混合物。磷酸二羟丙酮可以进入糖酵解代谢途径，而乙酰辅酶A将乙酰基中的碳原子输送到柠檬酸循环中被氧化以产生能量。

IolR是MI代谢中的一个关键角色，在许多细菌的MI代谢中起到负转录调控的作用，如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium Meliloti)、肠炎沙门氏菌(S.enterica)和新月柄杆菌(Caulobacter Crescentus)。在肠炎沙门氏菌中，IolR也参与了SrfJ(沙门氏菌III型分泌系统效应器)的调节。此外，在谷氨酸棒状杆菌中，IolR可以激活编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的pck的表达，从而抑制D-木糖的摄取。此外，IolR还可以通过抑制两个葡萄糖激酶基因的表达来阻断葡萄糖的摄取。肠炎沙门氏菌的体外研究表明，IolR直接调节可逆赖氨酸乙酰化(RLA)系统的表达。这些研究表明，IolR不仅是MI代谢的转录抑制因子，而且还参与其他基因表达的调控。

本研究探讨了IolR在嗜水气单胞菌NJ-35中的功能。作者观察到，由于参与肌醇代谢基因转录的显著上调，IolR的缺失显著提高了肌醇的利用效率。有趣的是，IolR的缺失通过上调RTX家族蛋白RmpA的表达而导致自聚集和生物膜形成的显著增加。

iolR失活对细菌生长的影响

为探讨肌醇代谢转录调控因子IolR在嗜水气单胞菌NJ-35中的生理功能及其致病意义，采用同源重组的方法构建了一株IolR基因缺失菌株。作者对细菌在LB培养基上的生长情况进行了评估，如（图1a）所示，ΔiolR的光密度略高于野生型菌株，但两株菌株同时进入指数期和稳定期，表明两株菌的生长动力学没有显著差异。这可能是由于LB中存在的其他碳源，如葡萄糖，影响了MI的利用率。因此，对ΔiolR和野生型菌株在以MI为唯一碳源的无糖M9培养基上的生长情况进行分析。如(图1b)所示，与ΔiolR突变体相比，野生型菌株出现大约24小时的生长延迟。因此，当基因iolR失活时，达到稳定期所需的时间显著缩短(图1b)，表明iolR对嗜水气单胞菌NJ-35的肌醇利用效率有负面影响。此外，在LB琼脂上，ΔiolR突变体在相同的培养时间内表现出比野生型菌株更大的菌落大小(图1c)。此外，ΔiolR突变菌落呈灰白色，而野生型菌株和CΔiolR菌株为浅黄色(图1c)。培养18h后，光镜下观察细菌，发现ΔiolR突变体有细菌聚集现象，而野生型和CΔiolR菌株未观察到细菌聚集。有趣的是，作者还注意到，当细菌在LB培养基中培养到固定相时，ΔiolR突变体在锥形瓶壁上产生了大量的生物膜(图1d)。用透射电子显微镜观察ΔiolR突变体发现，该菌株的表面覆盖着一层致密的缔合结构，而野生型和CΔiolR突变株的表面没有发现类似的结构(图1e)。此外，扫描电子显微镜图像显示，ΔiolR菌株的表面呈皱褶状，而野生型和CΔiolR菌株的表面看起来光滑，没有明显的特征(图1f)。

图1

iolR失活导致IOL基因转录显著上调

考虑到ΔiolR突变体比野生型菌株具有更高的肌醇利用率，作者进一步检测了ΔiolR品系中IOL基因的转录水平。iolR的缺失导致IOL基因的转录水平显著上调，编码假想蛋白(Hyp)的基因除外，而CΔiolR菌株IOL基因的转录水平恢复到野生型水平(图2)。结果表明IolR参与了IOL基因转录的负调控。

图2

IolR参与细菌自身聚集

如图1C所示，ΔiolR突变体在光学显微镜下显示出了细菌聚集现象，这表明iolR可能在自身聚集中发挥了一定作用。通过测定细菌培养上清液的OD600值进行沉降试验，以评价细菌的自聚集性。静置培养7h后，大多数ΔiolR细胞沉淀在试管底部，上清液透明，而野生型和CΔiolR菌株的培养液仍呈混浊状态(图3a)。接下来，作者比较了野生型和ΔiolR菌株的沉降动力学。如图3b所示，在iolR缺失的菌株中，静态生长过程中观察到OD600值迅速下降。培养7h后，ΔiolR菌株的自聚集率峰值比野生型菌株降低了69.4%。IolR基因的互补导致其自聚集特性的恢复。这些结果表明IolR参与了嗜水气单胞菌的自我聚集现象。

图3

IolR诱导的自动聚集现象需要Ca2+参与

此前有报道称，金属阳离子参与了细菌的自我聚集。为了确定iolR诱导的自聚集是否与金属离子的存在有关，作者在磷酸盐缓冲液(PBS)中用10 mM FeCl3、MgCl2、CaCl2和KCl测定了细菌的沉降系数。对于野生型菌株来说，当缓冲液中添加金属氯化物时，没有观察到明显的沉降(图4a)。然而，ΔiolR菌株在添加了CaCl2后发生了快速沉降，而在其他三种氯化物存在下没有观察到明显沉降现象(图4b)，并且在CΔIOLR品系中恢复了自聚集特性(图4c)。这些结果表明，IolR诱导的自聚集与Ca2+的存在有关，而氯离子对嗜水气单胞菌的自聚集没有影响。为了确定Ca2+浓度是否影响ΔiolR突变体的沉降，作者分别测定了嗜水气单胞菌在含1、5、10和20 mM CaCl2的磷酸盐缓冲液中的沉降动力学，同事测定了菌液的OD600，结果表明，Ca2+可以依赖性地提高嗜水气单胞菌的沉降速率。在20mM CaCl2存在下，120min后，ΔiolR菌株的自聚集能力峰值比野生型菌株降低了88.9%，这表明ΔiolR突变体比野生型菌株对Ca2+更敏感(图4d)。

图4

Ca2+介导的ΔIolR沉降可能与表面蛋白表达的增加有关，多糖和EDNA在细菌间和细菌-表面相互作用中起着重要作用。为了探讨细菌沉降的可能机制，作者用蛋白酶K、NaIO4或DNA酶I处理细菌培养物。用NaIO4或DNaseI处理细菌表面多糖后，ΔiolR突变体仍在含钙的PBS中表现出显著的自聚集，这可以通过肉眼明显地观察到(图5a，c)。然而，在用蛋白酶K处理细菌表面蛋白后，ΔIOLR菌株对Ca2+失去了敏感性(图5b)。

图5

IolR的失活增加了生物膜的形成

由于细菌自聚集是生物膜形成的关键步骤，作者研究了IolR在生物膜形成中的作用。如图6a所示，在未添加添加剂的培养基中，ΔiolR突变体的生物被膜形成比野生型菌株显著增加。此外，加入钙螯合剂EGTA后，Ca2+浓度与生物膜的形成呈负相关。随着EGTA浓度的增加，生物膜量减少。同样，作为胞外蛋白降解酶的蛋白酶K的加入抑制了ΔiolR突变体中生物膜的积累。激光共聚焦扫描显微镜分析表明，ΔiolR突变体的生物膜形成能力显著增强。10mM EGTA对ΔIOLR的生物被膜能力有一定的抑制作用。同样，添加80 mM蛋白酶K导致生物膜形成严重减少(图6c)。与激光共聚焦显微镜的结果一致，结晶紫染色对生物膜生物量的测定表明，与野生型菌株相比，ΔiolR增加了2.14倍，但当加入EGTA或蛋白酶K时，生物膜生物量显著下降(图6d)。这些结果表明，Ca2+和表面蛋白是iolR失活引起的生物膜生物量增加的关键。

图6

转录组分析比较

为了全面分析转录抑制因子IolR的功能，作者研究了野生型和IolR突变菌株的差异表达基因。在ΔIOLR中，共有447个基因差异表达(差异表达倍数>2.0倍)，其中234个基因表达上调，213个基因表达下调。图7a显示了差异表达基因热图，其中颜色强度增加的表示基因表达水平的增加。此外，作者根据GO分类对447个差异蛋白质进行了分类。如图7b所示，这些差异表达基因大多涉及膜部分、转运、细胞代谢和信号转导等功能。然后对20个基因进行定量PCR，包括10个上调基因和10个下调基因，以验证基因表达模式与转录数据变化模式一致(图7c)。

图7

IolR缺失导致自聚集现象需要U876_04005

根据转录数据，作者鉴定了5个在iolR突变体中表达上调的蛋白(U876_04005、U876_13290、U876_13510、U876_17900和U876_19910)。为了进一步研究ΔiolR突变体观察到的自聚集表型是否与这些蛋白相关，作者在ΔiolR背景下构建了单基因突变体，用沉降法测定细菌自聚集性。如图8所示，ΔiolRΔU876_13290、ΔiolRΔU876_13510、ΔiolRΔU876_17900和ΔiolRΔU876_19910仍能形成自聚集，而ΔiolRΔU876_04005中的自聚集现象消失。这些数据表明，U876_04005是IolR调控的参与聚集体形成的靶基因。此外，为了确定U876_04005介导的自聚集是否是钙依赖的，作者评估了ΔiolRΔU876_04005在添加10 mM CaCl2的PBS缓冲液中的沉降。ΔiolRΔU876_04005未出现自聚集现象，说明钙诱导的自聚集需要U876_04005。

图8

IolR缺失导致的生物膜形成增加需要U876_04005

如图9a所示，与ΔiolRΔU876_04005相比，ΔiolR U876_04005在管壁上产生的生物膜显著减少。扫描电镜观察到的细菌形态如图9b所示。ΔiolRΔU876_04005菌株表面光滑透明，与野生型菌株相似。与ΔIOLR相比，ΔIOLRΔU876_04005的生物膜厚度显著减少(图9c)，结晶紫染色定量显示生物量减少了69.31%(图9d)。这些结果表明，U876_04005可能与IolR缺失导致的生物膜形成增加有关。

图9

抑制子IolR与rmpA启动子结合

基于BLASTn的搜索和序列分析表明，U876_04005编码一个非常大的蛋白质，假设分子量为223 kDa。该蛋白命名为RmpA(登录号：AKJ33327)。氨基酸序列分析表明，RmpA由VCBS结构域(504-602aa)、VWFA结构域(1631-1761aa)、RTX基序(1913-2061aa)和I型分泌C末端靶区(2108-2175aa)组成(图10a)。VCBS结构域在许多大蛋白中被发现，这些蛋白被注释为粘附素或生物膜相关蛋白，并被预测与细菌粘附有关。VWFA结构域参与细胞间的接触，在原核生物中广泛保守。RTX基序由共同序列G-G-X-G-X-(D/N)-X-U-X的8个富含甘氨酸和天冬氨酸的非肽重复组成，其中X是任何氨基酸，U是保守的疏水残基(图10b)。这些重复序列形成了一个平行的β-Roll基序，用于结合钙。钙结合位点的存在得到了跨越RMPA400C-末端氨基酸区域的三维结构的电子模拟的进一步支持。如图10d所示，RTX基序中有5个可能的Ca2+结合位点。此外，RmpA的I型分泌C末端靶域表明该蛋白可能是由I型分泌系统分泌的。这些特征结构域提示RmpA可能是RTX家族的粘附素。

图10

根据上面描述的转录分析(图7)，当iolR被敲除时，rmpA的表达增加。为了测试IolR是否作为阻遏因子直接调节rmpA的表达，作者用含有rmpA可能启动子的DNA片段进行了电泳迁移率改变分析(EMSA)。EMSA结果表明，IolR能够与rmpA启动子区域结合，并表现出剂量依赖性的迁移率漂移。

结果

本研究证实IolR通过下调RmpA的表达减少嗜水气单胞菌的聚集表型和生物膜形成，从而进一步减少与钙的接触机会，进而抑制凝集形成和生物膜的形成所需的细胞-细胞相互作用。这项研究对IolR在嗜水气单胞菌中的作用提供了理论基础，并为寻找治疗这种细菌感染的药物靶点提供了新的线索。

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