做转录组测序前需要知道的那些事

转载2016-05-31 10:57:52

1.转录组的研究对象

转录组包括特定细胞或组织在某一时期内表达的所有RNA的集合，包括各种small RNA，lncRNA（long non-coding RNA）及mRNA等，因此做转录组测序理论上可以研究各种长度范围的RNA序列。针对转录组的测序，通常称为transcriptome sequencing，或简称为RNA-seq。

RNA-seq的研究对象，特定细胞的所有RNA，表格来自NATURE REVIEWS MICROBIOLOGY，（AJ Westermann et al.,2012)

2.转录组的建库和测序策略

根据不同的研究对象，需要选择相应的建库策略。

（1）如果研究的是mRNA，则可以通过富集polyA的方式来调取mRNA，进行建库测序；

（2）如果研究的是lncRNA或者lncRNA+mRNA，则可以通过去rRNA试剂盒的方式，去除rRNA后进行建库测序；

（3）如果研究对象是small RNA，则采用sRNA的建库策略，对18-40nt范围的sRNA进行切胶富集后建库测序。

根据不同的研究目的，又可以选择不同的测序策略。

（1）如果仅仅想了解不同样品间基因或sRNA的表达差异，则选择SE（single end）测序即可，测序量10M reads以上；

（2）如果需要进行基因的可变剪切、挖掘新基因、对现有基因的注释进行优化、检测基因融合等结构方面的分析，则建议选择PE（pair end）测序，测序量根据物种基因集合的大小，一般要至少2G以上的clean data。

3.基于转录组测序的主流研究手段

（1）RNA-seq denovo，基于序列组装，用于从头构建某物种的转录本序列；

（2）RNA-seq quantification，用于对已有参考基因序列的物种进行基因的定量；

（3）RNA-seq resequencing，对于已有参考基因的物种，进行基因定量、基因可变剪切、基因融合、新基因检测等分析；

（4）lncRNA-sequencing，主要研究lncRNA的表达量，预测新的lncRNA及其功能。

（5）sRNA sequencing，主要研究和分析small RNA序列，特别是miRNA的表达情况，并预测novel miRNA，miRNA靶基因分析等。

RNA-seq的主要研究手段及其研究点

4.转录组测序的优势及应用

优势：

（1）相对于芯片技术，转录组测序能够检测新基因和新的变异，且检测覆盖面更广，且准确性更高；

（2）相对于传统的一代测序技术，基于二代测序技术（NGS）的转录组测序则通量更大，覆盖面广，单碱基成本更低。

RNA-seq相对于其他技术的优势，表格来自NATURE REVIEWS GENETICS,(Zhong Wang et al.,2009)

应用：

（1）在动植物研究领域，可以通过转录组测序来从头构建某一物种的参考基因集，或者通过转录组测序的数据对已有的基因集进行补充和优化；

（2）在医学研究领域，可以通过转录组测序来找出疾病与正常组织差异表达的基因，或者寻找疾病组织特异表达的基因或转录本（融合基因、新转录本等），用于寻找疾病特异的biomarker。

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