文献信息

原名：Bacillus subtilis biofilm matrix components target seed oil bodies to promote growth and anti-fungal resistance in melon

译名：枯草芽孢杆菌生物膜组分促进甜瓜植株生长，提高植物抗病性

期刊：Nature Microbiology

发表时间：2021年06月06日

链接：https://doi.org/10.1038/s41564-022-01134-8

导读 

促生菌可以刺激种子发芽，但其机制很大程度上还是未知。枯草芽孢杆菌通常与不同的植物器官结合在一起，提高植株抗病性或刺激植株生长。报告表明，将枯草芽孢杆菌应用于甜瓜种子会导致种子的遗传和生理反应，从而改变5天和1个月龄植物萌发后的代谢和发育状态。我们分析了与种子相互作用的枯草杆菌生物膜细胞外基质的不同成分的突变体，发现细菌在种子贮藏组织的定殖和促进生长方面存在合作。结合共聚焦显微镜和荧光探针，我们发现细胞外基质的两种特定成分，类淀粉蛋白TasA和芬芥素，不同程度地增加了种子内活性氧的浓度。此外，利用电子显微镜，荧光显微镜和代谢组学技术，研究揭示了TasA 和芬芥素影响胚乳中的油体，导致脂质代谢的变化和谷胱甘肽分子的积累。另一方面，这个过程又导致了植物不同的生长发育策略。TasA和芬芥素刺激胚根的发育，而芬芥素单独刺激成株的生长和植物对真菌Botrytis cinerea的抗性。了解细菌促进生长的机制将使我们能够设计出特定的促生菌。

结果解读

1

枯草杆菌能调节定植植物的代谢和生长

有益细菌可以促进种子发芽的两个不同的、受基因调控的阶段，即发芽本身和新生胚芽的生长。与未经处理的种子相比，用枯草杆菌NCIB 3610处理过的甜瓜种子产生了较大的胚根（图1a）。然而，与未经处理的种子相比，经处理的种子的发芽率（胚根的最初出现）没有变化。我们分析了GA20ox1和CYP07A1的表达水平，这两个基因参与调节脱落酸和赤霉素的决定性比例，发现它们在处理过的种子和未处理过的种子之间有统计学上的相似性。用枯草杆菌悬浮液处理16小时后，对三组种子的转录组分析发现参与发芽相关激素信号通路的基因表达水平没有变化。然而，参与碳代谢和光合作用的植物基因有上调，对植物热休克蛋白和脂质贮藏囊结构蛋白有下调（油体膜蛋白和油体钙蛋白），以及激活了种子代谢（图1b）。

对比处理过和未处理过的种子的代谢组图谱，发现在用枯草杆菌细胞处理后的初始阶段（0小时），能量资源的丰度增加，如甘油磷脂和类似于三酰甘油（TAGs）的脂肪酰基（图1c）。在处理后24小时 ，两种条件下的代谢物水平相似，尽管这些脂质类别中的代谢物丰度的具体变化仍然很明显（图1c）。

用枯草杆菌处理发芽后的这些刺激作用是持久的，考虑到从处理过的种子中长出的1个月大的成年植物比从未处理过的种子中长出的植物有更强的根茎（图1c）。我们分析了从处理过的种子中长出的三株成年植物的代谢组，以确定与这种持久的生长促进作用有关的代谢变化。在经处理和未经处理的种子生长的植物地上部（叶子和茎）中检测到羧酸、脂类和类脂分子以及有机氧化合物是主要的差异代谢物类别，而根部的代谢组组成在经处理和未经处理的组之间没有显著差异。

脂肪酰基、羧酸、有机氧化合物和前醇脂的变化是种子经细菌处理后生长的植物叶片的主要代谢特征（图1e）。我们的代谢组学分析还显示，在来自处理过的种子的成年植物的叶片中，L-色氨酸和肉桂酸有不同的积累。这两个类别的分子都是有益的植物-细菌相互作用的生物标志物。

Fig.1枯草芽孢杆菌与种子的相互作用刺激了胚芽的发育，并导致对成株的生长促进作用。a左图：枯草芽孢杆菌种子处理后的平均±s.d.胚根面积。右图：未经处理的种子（左）和经枯草芽孢杆菌处理的种子（右）在处理后5天的代表性胚根；b接种种子和未经处理的种子在处理后16小时内通过转录组测序技术鉴定的DEGs的火山图；c与三酰甘油和甘油磷脂相似的脂肪酰基相对应的分子家族，在种子发芽后0小时内含量不同；d用枯草芽孢杆菌处理的种子（3610，右）或未经处理的种子（对照，左）的成株；e Circos图显示了与对照植物的叶片相比，加菌种子生长的植物的叶片中的前100种代谢物含量明显更高。

2

枯草杆菌细胞外基质与生长促进

我们通过在种子和胚根提取物上分离菌落，研究了种子处理后头5天内枯草杆菌种群的生长动态（图2a）。在胚根中，种群保持不变，在胚根出现时（处理后2天）几乎每个细胞都有孢子。然而，在种子中，细菌数量在处理后的前5天内增加，并在杀菌后4天内几乎完全变成孢子。这些结果表明，枯草杆菌细胞，主要是孢子，可能是被动地由胚根拖动，或者可能在种子内定植和增殖。野生型（WT）菌株和∆hag（鞭毛）、∆eps或∆srf突变型菌株的细胞密度没有变化，这些菌株分别具有改变的游动、滑动或群聚的运动能力，在种子内部的两个分化部分均没有变化（图2b,c）。总的来说，这些发现表明，促进生长的活动可能是由进入种子贮藏组织并定植的细菌细胞引发的，这个过程似乎并不特别依赖任何一种细菌的运动能力。

一些研究报告称，细菌生物膜对细菌与宿主的相互作用有多方面的贡献。在种子处理5天后，具有单一结构生物膜的突变体∆tasA、∆tapA、∆eps和∆bslA在种子提取物中的细胞密度与野生型细菌（设定为100%）的细胞密度相比大幅下降（图2d）。

在萌发的根茎中监测到具有类似的细菌种群模式，如上文对WT的描述，这可能反映了细菌细胞被拖动。∆srf、∆pks或∆pps菌株分别不产生次生代谢产物表面活性剂、杆菌烯或芬芥素（也存在于ECM中），与WT菌株相比，其种群动态没有变化（图2d）。在结构突变体中发现的细菌细胞数量的减少表明，与用野生型菌株处理相比，突变导致了根茎生长促进作用的明显下降（图2e）。与细菌细胞密度和植物生长促进之间的相关性相反，持久性差的∆tasA菌株保留了促进活性，而∆pks和∆pps菌株尽管在种子上有相当的持久性，却未能促进胚根生长 (图2d,e)。

最近有报道称，淀粉样蛋白TasA的缺失会引起枯草杆菌的重要生理变化。为了阐明TasA在ECM结构中的作用是否与依赖TasA的生长促进活性有关，我们使用了枯草芽孢杆菌菌株JC81，该表达的TasA版本不能恢复生物膜的形成，但能将ΔtasA细胞的生理状态恢复到野生型水平。用JC81处理种子未能促进胚根生长，但细菌在种子上的存活率与WT、∆pks或∆pps菌株的水平相当（图2d,e）。

这些结果使我们提出了三种不同的、互补的 ECM成分对促进种子根茎生长的贡献：首先，EPS、BslA和TapA在枯草芽孢杆菌细胞在种子中的生存能力方面有作用；第二，芬芥素（pps）和杆菌烯（pks）在枯草杆菌与种子的化学对话中具有作用；第三，类淀粉蛋白TasA参与了上述两种功能。

Fig.2 枯草杆菌的细胞外基质是有效的种子定植和刺激胚芽生长所必需的。 a在种子处理后的前5天，种子和胚根提取物中的枯草杆菌动态；b用WT和与运动能力有关的突变体处理4小时后，在珠孔（M）和合点（C）区域分离的带菌种子的提取物的C.f.u.计数；c用WT和运动相关突变体处理4小时后，菌苗种子总提取物的C.f.u.计数；d种子处理5天后，在种子提取物中测定ECM突变体相对于WT细菌的种子定植（假定为100%）；e左图：用WT细胞或ECM突变体细胞处理的种子（种子处理后5天）的胚芽生长增加的百分比，与未处理种子的平均胚芽面积（100%，虚线）呈正比。右图：未经处理的种子和用WT或ECM突变体细胞处理5天后的种子的代表性胚根。

3

溶血磷脂、谷胱甘肽和促进生长

根据我们的数据，TasA和芬芥素是与促进种子中枯草杆菌生长高度相关的ECM的分子。TasA与其他淀粉样蛋白一样，是一种多态的蛋白，具有各种结构构象，具有不同的生物化学和功能。我们聚合了纯化的均匀的TasA单体，表明大的聚合体能刺激胚芽生长。此外，从甜瓜种子中提取的新鲜根皮细胞液促进了TasA聚合成聚集体，表明TasA的这种主要活性聚合形式可能在种子内占主导。对刺激活性的评估表明，与未处理的种子相比，3μM活性最强结构的TasA溶液或10μM纯化的芬芥素溶液明显增加了胚芽的面积（图3a）。纯化的BslA蛋白或表面活性剂缺乏刺激活性，这证实了我们以前使用枯草杆菌突变体的发现（图2e和3a）。

我们分析了用芬芥素或TasA处理过的种子中出现的单个胚根（n = 3）的代谢组，以确定它们对与促进胚根生长有关的代谢特征的贡献。通过部分最小二乘判别分析的统计分析表明，在TasA或芬芥素处理的情况下，甘油磷脂、脂肪酰基、有机氧化合物或羧酸是判别的代谢物，这些特征的基于特征的分子网络显示整合到由其他代谢物组成的分子家族，这些代谢物通常遵循相同的丰度模式。该分析的进一步确定了两个感兴趣的分子家族：溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE），主要与TasA处理有关，以及还原型谷胱甘肽（GSH）的类似物，在芬芥素处理的种子生长的胚根中积累（图3b）。用市售的LysoPE或GSH处理种子，与用芬芥素或TasA处理一样能增加胚根的生长，但在用枯草芽孢杆菌处理种子1个月后，并没有在植物中产生长期的促进作用（图3c）。

谷胱甘肽是一种重要的多价代谢物，具有特殊的抗氧化功能，可以维持细胞的氧化还原平衡和植物的发育、生长或对各种刺激的反应。此外，谷胱甘肽总库的增加通常发生在活性氧暴露后3至4天，因此我们假设芬芥素处理的一个可能结果可能是活性氧的产生。用芬芥素处理后的种子中的活性氧水平在统计学上高于未处理的种子。在用TasA处理的种子中也观察到了活性氧的增加，但从统计学上讲，它比芬芥素引起的增加要少（图3d）。

Fig.3淀粉样蛋白tasA和芬芥素刺激胚芽发育。a左图：处理后5天，用纯化的ECM成分处理的种子的胚芽生长促进百分比与未处理的种子的平均胚芽面积（100%，虚线）呈正比。右图：未经处理的种子或处理后5天用纯化ECM处理的种子的代表性胚根；b与LysoPE和GSH对应的分子家族；c顶部：用水（C）、LysoPE和GSH处理5天后的代表性胚芽。底部：左Y轴，用水或纯化的LysoPE和GSH处理的种子的胚芽生长促进百分比，与处理后5天的对照胚芽面积（100%，虚线）进行归一；d 用水（对照组）、芬芥素或T asA处理种子后，立即对二氢罗丹明染色的种子内部组织进行共焦激光扫描显微镜的代表图像。

4

TasA和芬芥素以种子油体为靶点

用纯化的TasA或芬芥素处理促进了种子油体的体内分解，与用芽孢杆菌细胞处理后观察到的效果相似。透射电子显微镜（TEM）对阴性染色的种子薄片的分析显示，在用TasA处理的样品中，种子油体分解和种子油体周围的糖解体的定位。在芬芥素处理过的种子中，最主要的变化是种子油体的分解和细胞壁与细胞质之间空洞区域的出现，这表明浆液溶解，这是以前在芬芥素与真菌细胞膜的相互作用中观察到的细胞反应。对用TasA或芬芥素处理的甜瓜种子纯化的种子油体进行共焦激光扫描显微镜分析，并用固绿和尼罗河红进行双重染色，表明种子油体的大小和聚集模式的不同：芬芥素诱导种子油体的分解，正如在体内观察到的那样，而TasA优先诱导单个种子油体的聚集水平高于在体内观察到的那样（图4a）。在用TasA处理的样品中，种子油体聚集附近的绿色荧光信号强度较高，表明淀粉样蛋白的非特异性染色及其在囊泡周围的定位。种子全蛋白提取物的下拉试验结果表明，纯化的TasA与油蛋白共同稀释，油蛋白是调节种子油体稳定性和大小的结构蛋白，调节脂质代谢，在种子油体降解中具有重要作用（图4b）。纯化的TasA和来自拟南芥的纯化油肽的远红外印迹分析证实了这两种蛋白的相互作用（图4c）。

非靶向代谢组学分析提供了关于用TasA或芬芥素处理后0至24小时内代谢物相对丰度变化和种子代谢物潜在（生物）化学修饰的额外信息。使用ChemProp得到了TAGs类似物动态变化的推测。种子处理后TAGs类似物的动态变化（图4d）。在对照组的种子中，这个分子家族的许多修改表示在这段时间内对关键的储存代谢物发生了重要的催化活动。用TasA处理，更值得注意的是，0小时和24小时之间变化的重要性与这些分子催化活动的早期启动直接相关。与TAGs类似的变化在甘油磷脂的动态变化中也很显著。

Fig.4淀粉类蛋白tasA和芬芥素与种子油体的不同相互作用与它们对植物生长的特定刺激活性有关。a添加10µM芬芥素或3µM TasA后16小时纯化种子油体悬浮液的共焦激光扫描显微镜分析图像；b考马斯亮蓝（CBB）染色的SDS-PAGE凝胶，洗脱部分（E3和E4）用瓜子提取物中的蛋白质（左）和不含作为诱饵蛋白的T asA（右）进行下拉试验；c蛋白质印迹法；d未处理的种子（对照组）和处理后0小时至24小时内用芬芥素或TasA处理的种子中TAGs类似物分子家族的化学比例分析。

5

芬芥素能促进植物生长和对灰霉病菌的抵抗

从用芬芥素处理过的种子，其植株比从未处理或TasA处理的种子，其植株大（图5a）。然而，与来自未经处理的种子的植株相比，从用LysoPE或GSH处理的种子中生长出来的成年植株并没有显示出随时间推移的明显增长（图3c）。这些发现表明，不同的信号事件的存在支撑了由TasA、芬芥素或相关的LysoPE和GSH分子介导的短期根茎生长，以及与芬芥素相关的成年植物的长期生长。与芬芥素处理种子相关的GSH没有产生持续的长期生长促进作用，这表明需要一个持续的内源性触发器，只有通过芬芥素处理才能实现。TasA和芬芥素都增加了种子内部的ROS水平，但芬芥素引起的反应最高（图3d）。ROS的产生是种子萌发过程中第一次吸水后的正常反应，在一定的浓度范围内，ROS在endosperm weakening、对病原体的保护、种子储备的调动以及在种子萌发过程中与植物激素的相互作用方面具有公认的作用。这些结果表明，用芬芥素（而不是TasA）处理种子后，种子ROS的增加可能是由GSH积累介导的对植物进一步发育的有益刺激。

先前的研究表明，应用芬芥素会在成年植物中引起植物防御反应。因此，我们通过在成年植物的第三片叶子上接种灰霉病菌的孢子悬浮液，研究了用芬芥素处理种子是否能使成年植物对地上病原体产生免疫。用芬芥素处理过的种子种植的植物，由真菌诱发的坏死病变的大小明显小于对照植物或用TasA处理过的种子种植的植物（图5b）。对受感染叶片的转录组分析显示，在用芬芥素处理过的种子长出的植物叶片中，转录物的基础水平很高，其中一些与植物防御机制有关，如直接隐含在茉莉花酸生物合成中的氧化烯环化酶/合成酶。它们的表达在接种灰霉病菌48小时后保持或增加，而在来自未处理种子的成年植物中，由于对感染的反应而发现表达增加。第二，与谷胱甘肽代谢有关的基因，特别是包括谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）的上调，在受到灰霉病菌挑战48小时后发生（图5c）。GSTs参与抗氧化反应，加上重要的细胞抗氧化剂GSH，已被证明可以减轻由坏死性真菌灰霉病菌在感染组织中引起的氧化应激。来自芬芥素处理过的种子的根茎的代谢组数据表明，包括GSH的同一簇的某些分子的水平增加了（图3b），从加菌的种子生长的成年植物积累了属于GSH簇的某些分子，特别是在空中区域。此外，用芬芥素处理5天后，幼苗地上部分的代谢组也显示，除了黄酮类化合物等防御相关的化合物外，氧化谷胱甘肽和谷胱甘肽相关的代谢物也有所增加（图5d）。

Fig.5用芬芥素处理种子可以刺激成株的生长和免疫。a左图：用水（对照）、芬芥素或T asA处理的种子长出的代表性成株。右图：用水（对照）、10 µM 芬芥素或3 µM T asA处理的种子生长的植物的重量百分比，与对照种子生长的植物的平均重量（100%，虚线）进行标准化；b左：用灰霉病菌孢子处理72小时后，用水（对照）、芬芥素或T asA处理的种子生长的成年植物叶片出现坏死症状。右图：通过测量病变面积并将其归一化为对照叶片的平均病变面积（100%，虚线）计算的疾病百分比；c在对照组种子或用芬芥素处理过的种子用灰霉病菌孢子处理48小时后，通过总转录组分析在植物的叶片中确定的DEGs的火山图表示；d在用芬芥素处理种子120小时后，在幼苗地上部区域不同程度地富含氧化谷胱甘肽和相关代谢物的分子家族。

总结   

在这项研究中，我们证明，除了细菌ECM在生物膜形成中的结构作用外，它对枯草杆菌在甜瓜种子上的定殖和发挥促进生长作用，提高成年植物的抗病性也是必不可少的。我们的研究结果表明，枯草芽孢杆菌处理对甜瓜种子的有益影响与种子浸泡期间初始ROS的增加以及储存组织释放的代谢物的内容和特定库有关，这至少是由两种ECM成分--fengycin和TasA介导的。我们提出，TasA或fengycin与OBs的特定相互作用导致了两种不同的植物生长发育方案。首先，对胚芽生长的短期影响，由这两种成分介导，与油体的不同定位和脂质分解代谢优化后的TAGs动态变化有关。一方面，油素-TasA的相互作用决定了糖解体周围OB的聚集和随后作为生长信号分子的溶血磷脂的积累。另一方面，由芬芥素在膜上的作用引起的OB分解决定了其内容物的快速调动。其次是促进生长的长期效应，在成年植物中持续存在，由芬芥素介导，通过最初的ROS增加，引起GSH的积累，这种积累随着时间的推移而保持，使植物对生物胁迫的耐受性更强（图6）。

Fig.6 TasA和芬芥素对种子的生长促进作用的机制

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