题目：Strain-specific impacts of probiotics are asignificant driver of gut microbiome development in very preterm infants

期刊：Nature Microbiology

发表年月：2022年9月

第一作者：Lauren C. Beck

通讯作者：Christopher J. Stewart

第一单位：英国纽卡斯尔大学转化与临床研究所

DOI：10.1038/s43705-022-00168-7

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41564-022-01213-w

摘要

从出生开始，肠道微生物组的发展在短期和长期的健康中起着重要的作用，但影响早产儿肠道微生物组发展的因素却知之甚少。在本研究中，使用纵向宏基因组测序分析了123名早产儿（妊娠期<32周）的1431份粪便样本，这些婴儿在10年内没有发生肠道疾病或败血症。在研究期间，一组婴幼儿没有服用过益生菌，另外两组婴幼儿则服用了不同的益生菌产品: Infloran (Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus) ，Labinic (B. bifidum, B. longum subsp. infantis and L. acidophilus)。母乳、母乳强化剂、抗生素和益生菌与肠道微生物组显著相关，其中益生菌是最重要的影响因子。益生菌促使早产儿形成了不同的肠道菌群类型（PGCTs），每个菌群富含不同的双歧杆菌属，并与年龄的增加显著相关。功能分析显示PGCTs与粪便代谢物相关，且在早产来源的类器官中，无菌粪便上清液以PGCT特异性方式影响了肠道，类器官衍生的单层和基因表达。本研究确定了早产儿肠道微生物组发展的具体影响因素，其中一些因素与影响足月儿童的因素重叠。研究结果强调了益生菌产品中菌株特异性的重要性，以及它们对早产儿肠道宿主相互作用的影响

引言

塑造肠道微生物组发展的宿主和环境因素在足月婴儿中已有很多分析，但在明显早产的婴儿中研究较少。在足月婴儿中，出生方式和接受母乳是影响第一年肠道微生物组的主要因素。早产儿的相关工作产生了不一致的结果，可能由于较小的样本数和缺乏纵向采样。这些不一致强调了在没有肠道病变如坏死性小肠结肠炎（NEC）或晚发性败血症（LOS）的情况下，需要重点调查影响早产儿正常肠道微生物组结构和功能的因素。

孕期<32周的早产儿最初将在新生儿重症监护室（NICU）接受护理。这种独特的环境在肠道微生物组的获得和发展中起着至关重要的作用，这与威胁生命的疾病有关，包括NEC和LOS。这使得人们对益生菌在NICU中的使用越来越感兴趣，尽管益生菌在预防NEC和LOS方面的功效仍然没有定论，而且益生菌介导的NEC、LOS或死亡率降低的潜在好处需要与文献中报道的污染和益生菌败血症的重要的风险进行平衡。探讨益生菌对早产儿肠道微生物组发展的影响的研究很少，但已经表明，双歧杆菌能够在肠道内长期定殖。

在本研究中，对没有肠道疾病或LOS的早产儿进行了研究，旨在（1）描述早产儿在NICU住院期间肠道微生物组的纵向发展；（2）确定在生命早期这一关键时期，共变因素对细菌群落发展和功能的影响。

结果

该宏基因组分析包括从123名妊娠期小于32周的早产儿中纵向收集的1431个样本，这些样本是在英国的一个NICU中收集。大多数婴儿是母乳喂养（92.7%），接受配方奶的情况随着年龄的增长而增加。所有婴儿都摄入了牛奶（母乳、配方奶或两者）（图1a）和抗生素。本研究是在10年前开始，涵盖了益生菌引入前和两次连续使用益生菌期间。2011年至2013年期间出生的婴儿没有接受益生菌。然后在2013年将益生菌引入NICU，2016年中期开始补充Infloran(B. bifidum 1 × 109 colony-forming units (c.f.u.) and L.acidophilus 1 × 109 c.f.u.)，然后是Labinic（B.bifidum 0.67 × 109 c.f.u., B. longum subsp.infantis 0.67 × 109 c.f.u. and L. acidophilus 0.67 × 109 c.f.u.）

整体物种组成

对非细菌微生物进行了基于宏基因组（MetaPhlAn；真菌和古细菌）和VirMap（病毒）的研究。结果没有发现古细菌，只有11种真菌。Candida albicans和C. glabrata是丰度最高且普遍的真菌，分别在26个样本（14个婴儿）和15个样本（9个婴儿）中检测到。该方法可以检测DNA病毒，但只检测到两种：在7个婴儿的8个样本中发现cytomegalovirus，而在同一婴儿的两个样本中检测到betapolyomavirus[Jz1] 。另外，总共检测到394个细菌，因此随后的分析主要集中在细菌方面。

物种丰富度在婴儿出生后的前10天略有下降，好氧菌的相对丰度降低（图1b）。从第10天开始直到离开NICU，物种丰富度持续增加，Shannon多样性从出生到第45天呈指数增长，从第45天开始适度增加（图1b）。从出生到第80天，专性厌氧菌的相对丰度普遍增加，之后肠道微生物组由大约1:1的兼性厌氧菌和专性厌氧菌组成（图1c）。出生后的第一个月内，大部分革兰氏阳性细菌是葡萄球菌，其相对丰度较高。双歧杆菌（放线菌门）的相对丰度从出生到出院都在增加，从第30天开始是丰度最高的菌属。来自变形菌门的革兰氏阴性菌埃希氏菌和克雷伯氏菌在出生后的第一个月相对丰度增加，然后逐渐下降（图1d、e、f）。

通过细菌的Dirichlet’s multinomial mixture (DMM)模型确定了五个最佳的菌群，这里称为PGCTs。PGCT-1主要是肠球菌（Enterococcus faecalis和E. faecium）和葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis和S. haemolyticus）组成；PGCT-2主要是是大肠杆菌属（E. coli和一个未分类的物种）；PGCT-3是克雷伯氏菌(K. oxytoca和一个未分类的物种）；PGCT-4是一些双歧杆菌（B. longum、B. bifidum和B. animalis）和乳酸菌（L. acidophilus和L. rhamnosus）；PGCT-5主要是B. breve（附件图2）。

图1：出生后120天内早产儿饮食和肠道微生物组的概述（n = 1,431）

a，婴儿接受母乳、配方奶或 二者混合的样本比例。b-f，不同时间的丰富度和香农多样性 (b)、需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌的相对丰度 (c)、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的相对丰度 (d) ，前四个门的相对丰度（e）和前五个属的相对丰度（f）。

影响早产儿肠道微生物组的因素

Shannon多样性与出生后天数、益生菌（无益生菌/Infloran/Labinic）、接受母乳（从未/期间/之后）、母乳强化剂（从未/之前/期间/之后）和抗生素（过去7天内使用抗生素，无/有）显著相关（附件图2）。为了确定与整体菌群明显相关的共变因素，使用'adonis'进行PERMANOVA分析。出生后时间解释总变异的4%（P<0.001），母亲年龄解释了3.5%（P<0.001），而不同的患者解释了1.8%的变异（P = 0.016）。

在一个或多个时间点上，抗生素、母乳、母乳强化剂和益生菌与细菌分类学显著相关（图2a）。益生菌在统计学上是最显著的（P<0.05），除了第0-9天，在其他时间点都与细菌群落相关。微生物组的功能代谢的补充分析显示，只有益生菌在第10-14天、25-29天、30-34天、35-39天和50-69天有明显的关联（图2b）。值得注意的是，胎龄、出生体重、出生方式、配方奶和性别与分类学或功能层面上的整体菌群组成没有关系。该研究进一步试图用Olm等人以前发表的宏基因组研究来验证这些结果，该研究包含86个没有接受益生菌的对照早产儿（n = 513个粪便样本）。虽然喂养信息没有本研究那么细化，但各组之间的结果基本一致。

图2：由“adonis”建模的 12 个临床协变量在不同时间点的显著性和解释方差

圆圈显示了每个共同变量在特定时间点所解释的变异量（R2），显著结果用（FDR < 0.05）红色方框显示。

益生菌在肠道菌群中的作用

二项式混合效应模型显示，未接受益生菌的婴儿明显更有可能转变为富含克雷伯氏菌的 PGCT-3（P = 0.021），这也与出生时的较低胎龄有关（P = 0.043） ; 图 3a 和补充表 1）。接受 Infloran 的婴儿更可能转变为 PGCT-5，而接受 Labinic 的婴儿更可能转变为 PGCT-4（均 P < 0.001；图 3a 和补充表 1）。PGCT-4 和 PGCT-5 主要来自有较高的出生天数的样本（ P < 0.001；补充表 1）。PGCT-5 以 B. breve 为主，并与较高的胎龄相关（P = 0.008；补充表 1）。PGCT-4 通常以 Labinic 中存在的物种为主，包括B. longum，B. bifidum， L. acidophilus和B. animalis（附图 2c）。

与线性模型 2 (MaAsLin2) 的多变量关联分析证实，在接受益生菌的婴儿中，该益生菌中的属（附表 2）和物种（附表 3）有显著性更高的相对丰度。值得注意的是，B. breve 与 Infloran 显着相关（P < 0.001，q = 0.007），而 B. animalis 是与 Labinic 相关的最重要的分类群（P < 0.001，q < 0.001）（补充表 3）。使用基于培养的方法，本研究无法从 Infloran 组培养 B. breve，但始终能够从 Labinic 组培养 B. animalis。

益生菌对其它菌群的影响表明，在补充 Infloran 的婴儿中，E. faecium的相对丰度显著增加（P < 0.001，q = 0.004），而Veillonella parvula（P = 0.001，q = 0.030）和Propionibacterium acnes（P < 0.001，q = 0.022）显著降低（附表 3）。在补充 Labinic 的婴儿中，非益生菌种类没有显着增加或减少（q > 0.05；附表 3）。

使用 B. infantis 人乳低聚糖 (HMO) 基因簇（H1、H2、H3、H4、H5 和尿素酶）进行菌株水平分析以检测B. infantis亚种的存在，其中在这些簇中存在>90% 的基因的样本被归类为含有B. infantis。在 672 个样本中检测到 B. infantis，其中 666 个 (>99%) 来自接受 Labinic 的婴儿。对婴儿肠道菌HMO基因簇的额外分析确定了存在B. breve、B. bifidum和B. pseudocatenulatum中的同源物（图 3b 和附图 4a）。在从未接受过益生菌的婴儿中发现B. breve, B. dentium和B. longum（附图4b）。

与未接受益生菌的婴儿相比（P = 0.035），接受 Labinic 的婴儿的香农多样性显著更高，进一步证明了不同益生菌的影响（图 3c，d）。接下来试图确定每个益生菌中所含物种的流行率和持久性。与从未接受益生菌的婴儿相比，在服用相应益生菌之前、期间和之后，益生菌的流行率都显著提高（图 3e）。在益生菌组间进行比较，接受 Infloran组中双歧杆菌的流行率显著高于Labinic。与未接受益生菌的婴儿相比，接受Infloran组中的B. longum流行率明显更高（P < 0.001），并且B. animalis的流行率对 Labinic 益生菌具有高度特异性（图 3e）。在接受 Infloran 的婴儿中L. acidophilus没有持续存在，并且仅在少数接受 Labinic 的婴儿中持续存在，而 B. bifidum 在所有接受 Infloran 的婴儿中持续存在，只有接受 Labinic 的婴儿中没有持久存在（附图 4d，e）。

基于注释结果，发现益生菌是在任何时间点与整体酶功能（EC）显著相关的唯一协变量（图2b）。然而，与益生菌组相比，无益生菌组彼此之间的差异更大（图 3d），而服用任意一种益生菌的婴儿的功能谱比从未服用益生菌的婴儿更相似（图 3f）。MaAslin2 分析证实了这些结果，发现 346/754 (46%) 的EC 数通常与两种益生菌相关（附表 4）。在显著正相关的EC中，鉴定出大量参与形成碳-氧键和碳-氮键的糖基化酶和连接酶。相比之下，许多以硫基和其他含氮化合物为供体的氧化还原酶的相对丰度与益生菌呈负相关

图 3：益生菌是与早产儿微生物组相关的最重要的协变量

a，不同研究组的每个 PGCT 从出生后当天到69天的变化。b，B. infantis HMO 基因簇在其他物种中的流行率。c，代表每种益生菌类型的香农多样性的估计边际均值 (95% CI)。d，所有样本的分类谱的 NMDS 图（n = 1,431）。e，益生菌治疗之前、期间和之后益生菌的流行率。f，所有样品（n = 1,431）的 EC 数的 NMDS 图。

PGCT 的功能

接下来，研究试图了解基于微生物分类学定义的 PGCT 是否与肠道微生物组的功能相关。分析表明，PGCT 在其整体组成上存在显着差异（P = 0.001；图 4a）；然而，没有发现单一的酶或途径可以区分 PGCT。为了进一步探索 PGCT 的功能影响，本研究选择了代表每个 PGCT 的 10 个粪便样本的子集（n = 49）和匹配的血清样本（n = 50）用于非靶向代谢组学研究。总体而言，发现基于 PGCT 的样本之间的粪便代谢物谱存在显着差异（P = 0.043；图 4b），而匹配的血清代谢物谱则没有明显差异（P = 0.151；图 4c）。

与 PGCT-4/-5（与益生菌组婴儿相关）相比，PGCT-3（与无添加益生菌婴儿相关）中特定代谢物显著富集，反之亦然（附表 5）。在粪便中，与 PGCT-4/-5 相比，发现单一未知代谢物在 PGCT-3 中显著富集（P < 0.001，q = 0.0493；附表 5）。在血清中，与 PGCT-3 相比，发现单一代谢物lysophosphatidylcholine 20:3在 PGCT-4/-5 中显著富集（P < 0.001，q = 0.01；附表 6），没有代谢物在粪便和血清中都显著富集。

最后，为了探索每个 PGCT 的小分子对早产儿上皮屏障功能的影响，该研究使用了生理氧气条件下来自 25 周妊娠的早产儿肠源性类器官模型。代谢组学的每个 PGCT 的相同 10 个粪便样本被用于制造无菌粪便上清液，然后添加到分化的肠道类器官单层中 24 小时。根据共培养后的跨上皮电阻 (TER)（中位数 3,215.5 Ω，IQR 3170.75–3,265.5 Ω）和显微镜检查（附图 5）后确认单层细胞保持存活。来自类器官的转录组谱揭示了宿主对每个 PGCT 粪便上清液的特定反应，PGCT-4 和 PGCT-5 在 x 轴上的明显聚集（图 4d）。与培养基对照相比，暴露于 PGCT-4 和 PGCT-5 的类器官单层显示出最多的差异表达基因 (DEG)（图 4e），进一步证实这一点。通过 GO 对 PGCT-4 和 PGCT-5 暴露的单层中上调的基因进行分组，发现各种生物过程富集，其中有许多细胞和代谢过程，包括细胞蛋白质代谢过程（附表 7）。

图 4：PGCT的功能

a，所有样本（n = 1,431）的 EC分布的NMDS 图。b，c，粪便（b）和血清（c）代谢物谱的PLS-DA图（n = 50）。d，早产肠道类器官转录组谱的NMDS 图（n = 17；每组2-3 个）。e，Venn图显示了与对照相比的每个PGCT 的DEG 数量。

接受母乳强化剂、 母乳和抗生素与香农多样性和仅出生 1 个月左右时的肠道微生物组谱显著相关[Jz1] （图 2）。与从未接受过母乳喂养相比，接受母乳喂养后香农多样性显著增高（P = 0.012；图 5a），而在前 7 天给予抗生素的样品中，香农多样性显著降低（P < 0.001；图 5b）。与从未接受过母乳的婴儿相比，在接受母乳期间（P = 0.013，q = 0.154）和之后（P = 0.006，q = 0.09）采集的样本中双歧杆菌的相对丰度显著升高，葡萄球菌的相对丰度则在接受母乳期间（P = 0.013，q = 0.157）和之后（P = 0.003，q = 0.053；图5c和附表2）显著降低。物种水平的分析没有发现特定的双歧杆菌属。另外结果显示，前 7 天接受抗生素降低了双歧杆菌的相对丰度（P < 0.001，q < 0.001），但是增加了葡萄球菌的相对丰度（P < 0.001，q < 0.001；图 5d和附表 2）。在种水平上，B. bifidum, B. longum 和 B. breve 显著降低 (all P < 0.01, q < 0.1) ，但是S. haemolyticus, S. warneri和S. lugdunensis 显著增加 (P < 0.01, q < 0.2; 附表3)。

在功能水平上， transaldolase (EC 2.2.1.2)酶是在接受母乳期间和之后最显著相关的 （附表 4）。其他转移酶的相对丰度在接受母乳期间和之后也呈正相关，特别是糖基转移酶和那些参与转移单碳和含磷基团的酶。相比之下，大多数 EC 的相对丰度与过去 7 天接受抗生素呈负相关，例如参与形成碳-氮键和单碳基团转移的酶（附表 4）。与抗生素呈正相关的 EC 主要包括作用于硫基团的氧化还原酶和作用于成对供体的氧化还原酶。

图 5：母乳和抗生素与早产肠道微生物组显著相关

a,b, 代表母乳 (a) 和抗生素 (b)组 的香农多样性的估计边际均值 (95% CI)。c，d，箱形图显示了 接受母乳（c）组和抗生素（d）组中所有样品（n = 1,431）中双歧杆菌和葡萄球菌的相对丰度。

讨论

该研究对未出现肠道并发症或败血症的早产儿进行了最长的时间尺度的纵向宏基因组分析。结果表明益生菌是影响早产儿肠道微生物组的主要因素，其次是抗生素、母乳喂养和母乳强化剂。两种不同的益生菌产品改变了微生物组向不同 PGCTs的转变。PGCTs富含不同的双歧杆菌属，它们在功能和与宿主的相互作用中也存在差异。

通过已发表的文章样本验证，结果显示了与足月婴儿相比的重要差异 。研究表明新生儿重症监护室的护理方式和环境影响早产儿微生物组, 这在解释不同环境的研究结果时是很重要的。

在这项为期 10 年的观察性研究中，分析了两种不同益生菌产品的影响。结果显示一旦使用益生菌，在精准给药之前，就能在粪便中检测到益生菌物种。这种“交叉定殖”在之前的研究中已经出现 ，并且对益生菌试验设计具有重要意义。

先前对早产儿的研究表明，益生菌可以改变肠道微生物组。在本研究中，益生菌产品在分类和功能水平上影响了细菌群落。结果表明，补充 Infloran 或 Labinic 与过渡到两种不同的富含双歧杆菌的 PGCTs（PGCT-4 和 -5）有关。先前的研究发现，富含双歧杆菌的 PGCTs与健康相关 ，但之前尚未探索过其功能意义。

为了确定 PGCT 与宿主-微生物相互作用的相关性，对匹配的粪便和血清样本进行了代谢组学分析，并使用了实验性早产肠道类器官模型。总体而言，粪便的代谢物谱（而非血清）与 PGCT 相关。此外，发现含有代谢物和粪便其他成分的无菌粪便上清液以 PGCT 特异性方式影响早产儿上皮反应。患者的肠道区域（即小肠或大肠）和成熟度也可能影响宿主转录。尽管需要进一步的工作来确定益生菌给药引起的功能变化的潜在生物学意义，但这表明，在益生菌使用的驱动下，过渡到不同的 PGCT 具有相关的功能意义。

值得注意的是，治疗期间收集的粪便中排泄的补充菌株并不一定意味着肠道定殖。因此，本研究包括了对停用益生菌后菌株持久性的评估。已有的研究表明，益生菌和微生物定殖存在个体差异，以及治疗后益生菌种类的持久性存在差异，特别是与乳酸杆菌相比，双歧杆菌菌株的持久性更高，还观察到益生菌定殖的个体差异。与嗜酸乳杆菌相比，所有双歧杆菌属显示出更高的持久性，并且双歧杆菌和嗜酸乳杆菌（即两种益生菌中都存在的两种菌株）的持久性取决于所使用的益生菌。嗜酸乳杆菌的较低持久性可能反映早产儿肠道生态系统对该物种不是最佳的，因为它不是早产儿肠道微生物组中丰度较高或持久的细菌。这些结果显示了益生菌的短期和长期定殖，强调了了解菌株水平的短期和长期影响的重要性。

尽管益生菌在该人群中提供双歧杆菌属的早期来源具有明显的重要性，但本研究还确定了天然双歧杆菌定殖菌，即B. breve, B. dentium和B. longum 亚种。已有研究表明母乳通过提供HMO 具有双歧化作用。先前已显示利用 HMO 进行生长的所有双歧杆菌属，在这个早产样本的菌株水平上有显着变化。值得注意的是，母乳与双歧杆菌相对丰度增加和葡萄球菌相对丰度降低有关，而抗生素与双歧杆菌相对丰度降低和葡萄球菌相对丰度增加有关。

总之，本研究通过大量且纵向的早产儿群体中表明，益生菌产品以不同方式影响了肠道微生物群的发展，加速了向双歧杆菌属的转变。年龄最大的样本的菌群显示主要是 PGCT-4 或 -5。此外，这些 PGCT 在其功能和与宿主上皮的相互作用方面也表现出差异。这些结果有助于在设计针对早产儿肠道微生物组的干预试验时提供参考。

通讯作者

Dr Christopher Stewart，英国纽卡斯尔大学转化与临床研究所（https://www.ncl.ac.uk/medical-sciences/people/profile/christopherstewart.html），主要研究人类健康和疾病中的微生物组和宿主反应。研究小组通常侧重于新生儿到儿童期的微生物研究，分为两个主要领域，1）临床样本的多组学研究和 2）阐明微生物宿主互作和胃肠道疾病机制。

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