英文题目: Quantitative microbiome profiling disentangles inflammation- and bile duct obstruction-associated microbiota alterations across PSC/IBD diagnoses

中文题目：肠道菌群绝对定量分析揭示PSC/IBD诊断中与炎症和胆管阻塞相关的菌群变化

期刊名：Nature Microbiology

影响因子：14.3

发表时间：2020年

发表单位: 比利时鲁汶大学微生物学和免疫学系Rega研究所

样本信息

佛兰德肠道菌群项目队列（FGFP；n=1120）中观察到的非疾病相关个体作为健康对照；106个原发性硬化性胆管炎/炎症性肠病（PSC/IBD）粪便样本（PSC n = 18，克罗恩病（CD）n = 29，溃疡性结肠炎（UC）n = 13，PSC-CD n = 20和PSC-UC n = 26）。

研究摘要

最近的研究工作突出了混杂因素控制在微生物组关联研究中的重要性，例如，先前与肠道生态系统失调相关的多种病理表现出粪便浓度的伴随变化，这是微生物组变化的主要协变量，在这种情况下，观察到的微生物群变化可以在很大程度上反映粪便含水量的变化。此外，粪便中的水分变化与粪便微生物负荷（数量）的波动有关，从而在相对丰度分析中诱发了假象。因此，要鉴定肠道微生物与病理学中特定疾病表现之间的关联，就需要对微生物组变异进行去混杂和定量评估。在这里，我们重新审视了包括106例原发性硬化性胆管炎（PSC）/炎症性肠病（IBD）患者的微生物组数据集，通过定量微生物分类单元的绝对丰度，我们在控制粪便水分含量变化前提下研究了患者的微生物组变化，结果观察到具有低细胞计数的Bacteroides 2肠型的流行分布率增加，微生物负荷与肠道和全身炎症标志物水平成负相关。绝对定量分析使我们能够区分肠道炎症严重程度（Fusobacterium）或胆管炎（PSC）/ 胆道梗阻（Enterococcus）各自特异的微生物标记物，这些标记物是先前基于相对定量分析提出的PSC相关标记菌属。确定并验证了与炎症相关的Fusobacterium,Veillonella之间的近乎排斥模式，其中Fusobacterium的检测仅限于克罗恩氏病患者和PSC-克罗恩氏病患者。总体而言，通过肠道菌群绝对定量分析和混杂因素控制，我们筛选到了疾病相关的真实的微生物标记。

研究结果

根据属水平菌群组成的个体间差异，观察到合并患者组与66名年龄，性别和体重指数相匹配的FGFP健康对照组（mHCs）分开(图1a）。在患者和FGFP样品的属水平矩阵上使用DMM模型，我们观察到微生物组数据集可以分层为四个微生物肠型（Ruminococcaceae, Prevotella , Bacteroides 1(B1)，Bacteroides 2 (B2)）。除UC外，所有患者组的肠型流行分布率与mHCs相比均存在差异（图1b）。虽然11%的mHC样本为Bacteroides 2 (B2)肠型，但这种有害菌肠型的流行分布率在38%（UC患者）-78%（CD患者）之间变化，PSC和PSC-IBD则处于这个范围内。

图1 PSC/IBD队列的微生物组成与健康对照组不同。a,PSC/IBD队列和mHCs相对定量微生物组谱的个体间差异的主坐标分析；b,与健康对照组相比，患者组中B2肠型的流行分布率较高。

最近，我们报道了Bacteroides 2 (B2)肠型样品的微生物密度明显低于Bacteroides 1(B1), Ruminococcaceae和Prevotella等肠型样品，在这里，评估整个PSC/IBD/mHC队列的微生物丰度，我们确认B2是一种低细胞计数的肠型。

有趣的是，我们发现细胞计数在诊断亚组中有差异性分布，PSC-IBD或CD患者的微生物丰度明显低于MHC对照（图2a）。根据这些发现并根据所研究疾病的病理学，着手研究肠型，粪便微生物细胞密度和宿主炎症状态之间的潜在联系，在PSC/IBD/mHC队列中，分别使用粪便钙卫蛋白和血清C反应蛋白（CRP）浓度作为肠道和全身炎症的生物标志物，我们发现在B2型个体中两者均升高（图2b）。

除与炎症标志物有关外，粪便微生物负荷还与大便含水量有关。在本数据集中，我们确认粪便水分含量随粪便微生物细胞密度和肠型的变化而变化，在B2肠型样本粪便中观察到最高含水量（图2c），由于在IBD患者中经常观察到大便疏松并伴有肠道炎症增加，这些发现表明与疾病相关的微生物群改变可能仅由粪便含水量的差异引起。在B2肠型样本中，我们观察到的微生物负荷明显低于基于水分含量的预期负荷（图2d）。

此外，在预测样本肠型时，结合了含水量-炎症模型的解释方差与每个单独组成部分涵盖的方差之和相当，表示这两个变量对肠型分化的不重叠贡献。与其它肠型相比，组合模型在预测R和B2肠型方面表现最佳（图2e）。总体而言，在PSC和/或IBD患者中普遍存在的B2肠型粪便样本中观察到的低细胞计数，不仅反映了粪便疏松，而且与较高水平的肠道炎症直接相关。

图2  PSC和/或IBD诊断标记物、粪便细胞计数和炎症水平之间的关系。a，各个患者组之间的微生物负荷变化；b，通过粪便钙卫蛋白测得的肠型之间的肠道炎症分布；c，粪便水分含量（％）在不同肠型之间的分布；d，微生物负荷与含水量二次拟合残差在肠型间的分布；e, 基于钙卫蛋白水平和水分含量预测样品肠型的ROC曲线模型和模型预测公式的概率图。

结合扩增子测序和流式细胞仪，绝对定量菌群分析（QMP）可根据绝对丰度而不是相对比例来评估粪便菌群变异。绝对定量菌群分析（QMP）降低了下游分析中的假阳性率和假阴性率，降低了微生物组关联错误解释的风险。将QMP应用于PSC/IBD/mHC数据集，我们确定11个菌属与粪便钙卫蛋白浓度显著相关（图3a），大便含水量与45个微生物分类单元相关。结合这两个变量，在控制粪便含水量变化时，11个与粪便钙卫蛋白浓度相关的细菌属中只有6个保持显著性相关：Anaerostipes (−) , Escherichia (+) , Fusobacterium (+) , Gemmiger (−) ,Streptococcus (+)，Veillonella (+)（图3a）。

考虑到它们对疾病严重性的潜在影响，我们对与钙卫蛋白水平相关菌属的丰度进行了taxon-taxon相关性分析，并在独立的IBD队列中验证了这一发现（图3b）。在经过验证的关联中，我们着重指出在PSC/IBD患者的粪便样本中，Fusobacterium 和Veillonella（尽管两个菌都与粪便钙卫蛋白浓度呈正相关）之间观察到了令人惊讶的近乎排斥模式（图3b）。

图3  PSC/IBD/mHC队列中与粪便水分、胆道梗阻和炎症水平相关的定量菌属分布。a，菌属绝对定量丰度与粪便含水量、粪便钙保护素浓度、血清ALP水平的相关性，以及控制粪便含水量时菌属绝对定量丰度与钙保护素或ALP水平之间的相关性。b，控制粪便含水量时与钙卫蛋白水平相关菌属的taxon-taxon相关性分析；c，仅在两个属（Veillonella和Fusobacterium）之间观察到的近乎排斥模式，尽管两者均与肠道炎症呈正相关。

虽然在所有疾病组粪便样本中都发现Veillonella，但高丰度Veillonella样本是CD或PSC-CD患者的特异性样本（图3b）。有几项研究探讨了Veillonella，特别是Fusobacterium在增强促炎症环境中的因果作用，与目前的研究结果相比，这两个属被报道在口腔生物膜中共存以增加氧化应激抵抗力。亚属种类分析显示，在核心PSC/IBD /mHC队列中，Veillonella和Fusobacterium的丰度随着肠道炎症的增加而增加。

以前，在相对丰度分析的基础上，我们确定Enterococcus, Fusobacterium, Lactobacillus是PSC患者的潜在marker菌属，其在PSC患者和PSC-IBD患者中的相对丰度均升高。在这里，通过绝对定量菌群分析（QMP）确定Fusobacterium只与炎症有关，同时发现Enterococcus与血清碱性磷酸酶（ALP）水平特别相关，ALP是胆管阻塞严重程度的标志，即使在消除粪便水分变化的情况下也是如此（图3a）。QMP分析发现Lactobacillus与钙保护素或ALP之间没有明显的相关性。总而言之，我们由此得出结论，Enterococcus，Escherichia, Fusobacterium, Streptococcus，Veillonella分别是胆管阻塞和胃肠道炎症的有希望的，特异性的，跨疾病的标记物。

研究结论

总之，我们显示了粪便水分含量，粪便钙卫蛋白水平和CRP浓度如何与粪便细胞计数和Bacteroides 2肠型密切相关。绝对定量菌群分析（QMP）可以炎症相关微生物和与胆道梗阻严重程度相关微生物区分开来（大便含水量变化除外），并揭示了炎症水平较高患者中的Veillonella，Fusobacterium呈现相互排斥的模式。总之，我们的分析表明，当考虑患者的生理生物标记物而不是诊断因素时，可以检测出统一的，跨疾病的定量微生物组模式。

常规扩增子测序和qPCR技术痛点

常规16S扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但是其是通过某一OTU分类单元的序列数所占总序列数的比值来获得某个细菌的相对丰度比例信息，然而相对丰度信息不能反映样本中物种真实的绝对丰度情况，例如微生物某一类群的相对丰度比例增加不一定真正是相应微生物类群的绝对丰度增加，可能是其它微生物类群的绝对丰度减少是导致其在群落结构中相对丰度比例的增长，因此常规16S扩增子测序技术基于相对定量分析的错误结果解释可能导致假定的因果关系！

qPCR绝对定量技术虽然可以进行物种绝对定量分析，但是qPCR定量实验结果常常不稳定，且特定物种qPCR需要设计特定引物，对引物特异性要求较高，且引物优化难度较大，导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。此外，当环境样本中往往含有腐殖酸，这些腐殖酸会通过抑制酶的活性抑制PCR，从而影响qPCR对细菌拷贝数定量结果的准确性。

天昊16S扩增子绝对定量测序技术简介

该技术是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术，该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析、指标和微生物相关性分析等常规16S扩增子测序分析，关键可以解析样本中总细菌的绝对拷贝数，还可以解析样本中每个物种的绝对拷贝数，因而对微生态学内许多悬而未决的问题具有进一步阐明的潜力。此外，该技术进行细菌拷贝数定量时，构建标准曲线的内标和样本DNA是在同一个样本孔中一起进行PCR反应，所以PCR反应效率相同，因此校正了腐殖酸对PCR的影响，避免了腐殖酸等PCR抑制物对样品细菌16S拷贝数定量的影响，因此针对土壤、水体和淤泥等环境样本，天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术计算得到的细菌16S拷贝数相对于qPCR更准确。

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