点击蓝字，关注我们

根际“有害”代谢物驱动发病根际微生物群落组装

Specific metabolites drive the deterministic assembly of diseased rhizosphere microbiome through weakening microbial degradation of autotoxin

Microbiome [IF = 16.87]

DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-022-01375-z

Published online  2022.10

第一作者：Tao Wen（文涛）

通讯作者：Jun Yuan（袁军）(email: junyuan@njau.edu.cn)

01

摘要

背景：根际微生物群落的组装及其功能与植物健康的维持密切相关。但是在土壤恶化的过程中根际群落的组装和功能的变化仍不清楚。我们通过比较配对的患病/健康样品的测序数据，解析了根际微生物的特征以及组装过程。利用非靶向代谢组学探索潜在的群落组装驱动因素，并通过宏基因组测序解析了特定代谢物添加后介导的土壤调节机制。

结果：五个代谢物（醋酸生育酚、瓜氨酸、半乳糖醇、十八烷基甘油和山萮酸）与患病的根际土壤微生物的组装过程显著相关。这些代谢物施加会导致微生物群落确定发育，并导致较高的西瓜发病率。此外，代谢物的施用削弱了具备降解自毒物质的细菌（Bradyrhizobium、Streptomyces、Variovorax、Pseudomonas和Sphingomonas）含量，而促进了另外一些代谢小分子糖和酸的细菌（Anaeromyxobacter、Bdellovibrio、Conexibacter、Flavobacterium和Gemmatimonas）。

结论：这些发现有力地表明，小分子代谢物主导土传镰刀菌枯萎病微生物群落的确定性组装过程，阐明了该过程的微生物变坏特征，对土传病害的生物防控提供了方向理论指导。

02

前言

根际微生物群落在促进作物生长、维持作物健康等方面发挥着重要作用。然而，某些根际微生也会对根际土壤微生态的多样性或组成造成负面影响，从而导致土传病害的发生，作物产量的下降。作为土传病害的代表之一，由病原真菌尖孢镰刀菌引起的枯萎病对作物具有强破坏性，并且其在农业生产系统中也具有广泛的寄生范围；甚至针对不同的经济作物，病原体也衍生出了诸多专化小种。由病原真菌引起的作物感染开始于根尖部位，最终迁移到未成熟的木质部，并导致作物产生不同的发病症状，如根腐病、枯萎病和立枯病等。已有研究表明，枯萎病会改变根际微生物群落的组装过程。然而由于土壤生态系统的复杂性以及作物、土壤类型、遗留效应、气候、pH值和其他因素之间的相互作用，导致许多研究中关于根际微生物群落和枯萎病关系的描述和结论不同。通过整合公共的测序数据，可以用于寻找跨区域、不同植物类型的共同响应。例如通过整合测序数据研究者发现pH是影响小麦根际土壤固氮微生物群落组装的关键因素，盐度是影响沙漠生态系统中土壤微生物群落组装的决定性因素。先前的研究通过机器学习的方法解析了枯萎病与健康/发病土壤中细菌和真菌群落的特征，包括45个特征细菌和40个特征真菌OTUs，依据这些OTU可以精确地判断土壤的健康状况。土壤中的非生物和生物因素都会影响根际微生物群落的组装。根系分泌物既是土壤中微生物的营养来源又是信号分子，在根际微生物群落构建过程中发挥重要作用。然而根系分泌物-微生物的相互作用对植物既有有利的影响，也有负面的影响。例如根际分泌的水杨酸和长链有机酸等可以招募有益微生物来抵御病原体，而酚酸和花生四烯酸等则对根际微生物群落的组成产生负面影响。这种负面影响可能会导致作物在长期连作条件下的微生物群落转变为“病态”微生物群落。据报道，在黄瓜根部分泌的代谢物中，肉桂酸会增加病原菌的相对丰度从而导致黄瓜枯萎病的发生。然而，根系分泌物如何调控根际微生物群落组装，从而影响作物健康的过程或机制知之甚少。为了解决这些问题，我们合并了多项来自枯萎病发病和健康作物根际土壤的测序数据，然后通过计算群落形成过程指数（β-nearest taxon index，βNTI）来评估微生物群落的组装过程。同时利用非靶向代谢组学鉴定影响根际微生物组装的特定代谢物，然后识别出其中诱导微生物群落向“发病”状态转变的“关键”代谢物。本研究旨在解决以下问题：1、解析病害（枯萎病）和健康植物根际土壤微生物群落的组装模式；2、研究根际代谢物驱动病害根际微生物群落的组装机理。

03

结果

1 确定镰刀菌枯萎病发病微生物群落的组装过程

为了去评估发病根际微生物群落的组装过程。首先在全中国不同纬度、不同地理环境采集了四种作物连作下的发病土壤和对应的健康根际土壤样品，并对根际土壤进行微生物组测序与分析 (Figure 1a)。通过对配对样品的微生物群落组装过程分析，观察到这四对发病样本的细菌群落组装过程主要受到确定性支配（|βNTI| > 2）(Figure 1b-c) ，而在健康样本中发现了不同的结果(2 对 βNTI > 2, 2对 |βNTI| < 2) (Figure 1b)。为了进一步探索群落组装过程，随后从公开数据库中45项独立研究中收集的859个样品用于进一步验证组装过程，结果表明发病根际土样品中的|βNTI|均值大于2，而健康根际土中的βNTI值浮动在2和-2之间，表明健康样本中的微生物群落是随机过程（|βNTI| <2），也说明大多数健康样本受到的选择性压力较弱。为了再进一步明确是否确定性选择主导了发病细菌群落的组装过程，开展了盆栽实验模拟发病土壤形成过程，直到连作土壤发生严重的枯萎病时停止。随着连作季数的增加，枯萎病发病率从第1季到第8季逐渐增加（Figure 1g），到第八季时作物枯萎病发病率达到80%左右。接下来对第一季，第五季和第八季根际土取样进行16S rDNA基因测序。随着黄瓜连作季数的增加，到第8季时，|βNTI|值大于2，RCbray分析也表明确定性选择在样本对中的占比逐渐上升。

2 挖掘驱动发病根际确定性组装的小分子代谢物

通过气相色谱高通量飞行时间质谱仪（GC-TOF-MS）对四对发病和健康根际土壤样本进行了小分子代谢物的测定，结果发现，共检出798个色谱峰，其中有265个为已鉴定化合物，包括了45种氨基酸和酰胺、23种醇、21种长链碳有机酸、27种短链碳有机酸、5种核苷酸、36种糖、7种糖酸、4种糖醇、8种酯和89种其他物质。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）表明，发病样本和健康样本的根际代谢物组成存在显著差异（adonis, p = 0.001, permutation = 999）(Supplementary Figure 2)。使用随机森林构建分类模型，以区分发病和健康根际的代谢物。最终生成两个准确率较高的模型，能够很好地区分发病和健康两组代谢物整体差异，并在这两个分类器中一共得到100种特征代谢物。同时，通过非参数检验对全部代谢物进行差异分析，发现了130种化合物在发病组和健康组之间表现出显著差异（p < 0.05）。结合随机森林和差异分析的结果，共筛选出10种重要的差异代谢物，分别是：4-羟基扁桃酸、生育酚乙酸酯、L-蛋氨酸、富马酸、瓜氨酸、甘氨酸、莽草酸、半乳糖醇、十八烷基甘油和山嵛酸共10个化合物。使用Mantel检验确定出了与发病微生物群落组装过程显著相关的五种化合物（生育酚乙酸脂、瓜氨酸、半乳糖醇、十八烷基甘油和山嵛酸）(Figure 2c, p < 0.05)。这五种物种被用于后续的微生物群落组装验证以及发病率实验。

3 小分子代谢物对群落组装和镰刀菌枯萎病发病率影响

我们选择了两种类型的土壤用于验证添加两种浓度（1 μM 和100 μM）的五种代谢物对微生物群落的影响。八周后，对培养土壤进行盆栽验证实验枯萎病发病率。在1 μM和100 μM浓度的代谢物处理的土壤中西瓜枯萎病的发病率与对照相比（CK）显著提高(Figure 3a)。与对照相比，土壤1和土壤2的枯萎病发病率分别增加了25.33%（1 μM）、37.11%（100 μM）和26.88%（1 μM）、38.44%（100 μM）。并且测序结果表明示，不同处理后的细菌群落存在显著差异(Supplementary Figure 5)。在100 μM混合代谢物的处理下，根际土壤微生物群落多样性显著下降 (Figure 3b)。对1 μM和100 μM处理（C1，C2）的土壤微生物群落进行群落组装分析，发现两种浓度物质的添加均会驱动根际细菌群落的确定性组装（|βNTI| > 2）。而两种土壤的对照组中发现|βNTI| < 2，表明了对照土壤组装过程以随机性为主。

4 代谢物驱动发病土壤微生物功能分析

为了探索施用特定代谢物后土壤群落功能的变化。对土壤样品进行宏基因组测序，从36个样品一共获得了108 G的原始测序数据，每个样品的数据量约为30 G。基于Bray-Curtis距离的PCoA结果表明处理之间存在显著差异（MRPP检验：delta：0.06；p = 0.001）（Supplementary Figure 6）。对土壤培育实验中的所有组别两两（S1C1 vs S1CK；S1C2 vs S1CK；S2C1 vs S2CK；S2C2 vs S2CK）之间进行了GSVA富集分析，将在多组（3/4）对比中均出现的功能通路识别为“重要途径”。这些途径主要包括自毒物质降解（硝基甲苯降解、花生四烯酸代谢等）、小分子糖代谢（果糖和甘露糖代谢）、有机酸代谢（柠檬酸循环代谢、脂肪酸降解、丙酮酸代谢等）和氨基酸代谢（如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢）(Supplementary Figure 7-10)。然后归纳了特征代谢物处理后上调和下调的通路，发现自毒素降解能力（如硝基甲苯降解、花生四烯酸代谢、多环芳烃降解、萘降解、二甲苯降解、苯乙烯降解和二噁英降解）在代谢物处理后的土壤中普遍显著下调(Figure 4a; Supplementary Figure 7-10)。这些功能主要是通过一个特征微生物群体（FM1）来驱动的，包括Bradyrhizobium, Streptomyces, Variovorax, Pseudomonas和Sphingomonas（(Figure 4a)。小分子糖类（果糖和甘露糖代谢）、有机酸和氨基酸（柠檬酸循环代谢；脂肪酸降解；丙酮酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）的代谢途径受到代谢物的影响表现出显著上调，这些功能主要是通过另一个特征微生物组（FM2）驱动，包括Anaeromyxobacter, Bdellovibrio, Conexibacter, Gemmatimonas 和 Flavobacterium 对土壤培养实验第一季（1st，被认定为健康）和第八季（8th，被认定为发病）的土壤样品进行了宏基因组测序，进一步验证发病微生物群落的功能特征。结果显示第一季和第八季中的微生物群落组成具有明显的差异（MRPP：delta：0.051；p = 0.028）。GSVA富集分析证实了多环芳烃降解和花生四烯酸代谢功能在发病土壤中显著下调，这些通路同样由微生物群体FM1驱动，而小分子糖、有机酸和氨基酸的代谢通路在发病土壤中显著上调，这些通路由FM2驱动。同时发现FM1菌群在从健康到发病（从第1季到第8季）过程中丰度呈上升趋势，而FM2在这个过程中则呈现出丰度逐渐下降的趋势。除了自毒物质降解的功能表现出差异外，其他功能（泛醌和其他萜类-醌的生物合成、万古霉素类抗生素的生物合成和烯二炔类抗生素的生物合成）在健康的根际微生物组中得到了富集。

04

讨论

本研究中，我们结合多项独立研究的测序数据以及连作模拟实验的枯萎病根际土壤的测序数据，识别出与枯萎病相关的微生物群落特征。结果显示细菌群落多样性较低与疾病有关，这与早期的发现一致。基于网络分析，与发病网络相关的连接群落数量较少，反映出群落内微生物-微生物相互作用较弱。以前的研究也将病害与微生物网络中较低的连通性联系在一起。例如，香蕉枯萎病微生物网络中的网络连接数量减少，而健康根际土壤的网络中存在更多的连接。发病样品中的Kaistobacter、Mesorhizobium、Bacillus、Anaeromyxobacter、Bdellovibrio、Conexibacter和Flavobacterium是发病根际微生物组的微生物特征。然而，通过交叉验证确定的前50个特征微生物中，大多数在患病的根际土壤中有更高的丰度。这表明发病样品和健康样品相比，其微生物组可能具有更统一的特征。同时与健康样品相比，发病样品中群落的变化较小。这表明镰刀菌枯萎病介导的生物胁迫带来的同质化效应与干旱以及盐胁迫的影响相似。这种同质化效应成为研究镰刀菌枯萎病胁迫下根际微生物组组装过程的基础。

微生物群落的组装过程分为四个基本过程（多样化、扩散限制、可变性选择和漂变），可用于评估不同环境场景下的微生物组装过程。本研究中，我们使用这种方法探索了镰刀菌枯萎病与健康土壤中根际微生物群落的组装过程。发现在发病根际细菌群落中，确定性选择过程占主导地位，而在健康样本微生物群落中，随机过程占主导地位，这表明在发病样品的根际群落中面临强烈的选择动力。代谢组学的发展极大地促进了我们对植物-微生物相互作用的理解。植物会分泌有机代谢物为微生物的生存提供养分，并且从土壤微生物中获得有益的帮助。例如，以水稻和葡萄为研究对象建立的土壤根系微生物组的多步组装模型，证明了根系分泌物的作用；野生燕麦（Avena barbata）的微生物群落组合模式与根系分泌物的动态变化密切相关；洋桔梗枯萎病的发生与根际代谢物密切相关。在本研究中，健康和发病样品的根际代谢物存在明显差异。五种代谢物（生育酚乙酸酯、瓜氨酸、半乳糖醇、十八烷基甘油和山萮酸）在发病的根际土壤中富集。随后的分析表明这些代谢物是驱动微生物群落组装的“关键”成分。作物受到多种胁迫时均会富集瓜氨酸，在受到枯萎病侵染的西瓜根际中会显著富集瓜氨酸。生育酚乙酸酯是维生素E家族的一员，在植物受到多种胁迫下会大量分泌；芝麻在盐胁迫下会分泌大量山嵛酸。我们在发病的根际土壤中检测到了大量的生育酚乙酸盐和山嵛酸。在后续的实验中发现这些代谢物和混合物对发病微生物群落中的组装过程至关重要。表明了这些代谢物可能是植物面对生物和非生物胁迫的共同反应。但是并非所有根际代谢物都会改变微生物群落的组装过程。例如在分析之前的一项研究中的测序数据时发现黄瓜的四种有机酸代谢物（柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸和富马酸）并不影响微生物群落的组装过程。本研究中这五种代谢物可以改变微生物群落组装过程，并影响植物枯萎病发病率。

我们发现发病根际群落自毒物质降解能力降低，这可能是病害发生机制之一，相关研究表明自毒物质的积累会因养分不平衡和微生物功能失调而导致连续耕作障碍。进一步测序结果显示大量的降解自毒物质的通路在发病根际土壤中消失，这些降解能力的下降与微生物群体FM1（Bradyrhizobium, Streptomyces, Variovorax, Pseudomonas和Sphingomonas）的相对丰度的下降有关。研究表明这些微生物对维持植物健康具有多种潜在的有益作用，如抗生素生产、根系定植和ISR激活等。与之相反的代谢“易获得性碳”的通路在发病土中显著上调，这可能提高可利用碳的代谢，增加病原菌的丰度。小分子有机酸可以通过抑制病原菌的生长、招募有益微生物等从而提高植物对枯萎病的抗性。然而有机酸代谢通路的富集可能削弱潜在有益微生物的功能。Anaeromyxobacter, Bdellovibrio, Conexibacter, Gemmatimonas和Flavobacterium是小分子有机酸代谢的主要贡献者。此前已有报道以上五种细菌群落都在土壤和/或根际环境中存在，他们往往被认为是植物病原菌。因此FM1和FM2可能在维持植物健康上发挥重要功能。未来的研究需要识别这些“潜在重要”的微生物的功能或是在枯萎病微生物群落中的作用。

袁  军  南京农业大学资源与环境科学学院副教授；研究方向聚焦于根际代谢物介导根际互作过程；主持国家自然科学基金青年、面上项目等10余项科技项目；以第一作者或通讯作者在Microbiome，ISME J， Fundamental Research， iMeta，PCE，SBB 等期刊发表论文20余篇，被引超过2000次；获得江苏省优秀青年基金和“青蓝工程”优秀骨干教师称号。

文  涛  南京农业大学钟山青年研究员， iMeta 期刊青年编委，“微生信生物”公众号创始人；研究方向为根际微生物生态，擅长使用多组学解析土壤微生物群落过程，开发了ggClusterNet, EasyStat等R包, Easyamplicon, Easymetabolome等组学分析流程。以第一作者在Microbiome，ISME J， Fundamental Research， iMeta，Horticulture Research，SEL，BMC plant biology等期刊发表论文10余篇。

根际互作生物学研究室 简介根际互作生物学研究室是沈其荣院士土壤微生物与有机肥团队下的一个关注于根际互作的研究小组。本小组由袁军副教授带领，主要关注：1.植物和微生物互作在抗病过程中的作用；2 环境微生物大数据整合研究；3 环境代谢组及其与微生物过程研究体系开发和应用。团队在过去三年中在 Microbiome，ISME J，Fundamental Research，iMeta， PCE，SBB，Horticulture Research，SEL，BMC plant biology等期刊上发表了多篇文章。欢迎关注 微生信生物 公众号对本研究小组进行了解。
撰写：文涛，谢鹏昊
修改：文涛，袁晓航审核：袁军
团队工作及其成果 （点击查看）

• 团队关注

• 团队文章成果

• 团队成果-EasyStat专题

• ggClusterNet专题

• 袁老师小小组

了解 交流 合作

• 团队成员邮箱 袁军：junyuan@njau.edu.cn；文涛：2018203048@njau.edu.cn

• 团队公众号：微生信生物 添加主编微信，或者后台留言。

• 点击查看团队github主页

• 点击查看南京农业大学资源于环境科学学院主页