本文将围绕无创产前检测（Non-invasive Prenatal Testing, NIPT），为初入NIPT研究的新人提供基础知识，为生物信息研发人员梳理相关文献、总结关键研究内容。

一、NIPT研究背景

1. 染色体异常分类

从宏观到微观，染色体异常可分为：染色体层面的ROH异常、多倍体、非整倍体异常、染色体局部的拷贝数异常、基因层面的插入缺失异常，分别对应不同的研究领域以及研究方法。孕期胎儿染色体异常种类检测如下：

2. 非整倍体异常

正常人细胞核内有23对共46条染色体，其中22对常染色体，1对性染色体。男性性染色体由一条X染色体和一条Y染色体组成，而女性是两条X染色体。染色体的数目异常包括整倍体和非整倍体两种情况：

整倍体：以人的一个染色体组(即n=23)为基数，整倍的增加或减少，正常人是二倍体，三倍体3n，有69条染色体，以此类推。如果胚胎为单倍体或多倍体是无法存活的。

非整倍体：当细胞染色体数目增加或减少了一条或数条，则称为非整倍体，是临床上最常见的染色体异常。我们最熟知的21三体唐氏综合征等属于这一类型，这类患者比常人多了一条21号染色体，主要表现为智力、生长发育迟缓、头面部特征等，非整倍体的产生往往与细胞分裂时染色体不分离、染色体丢失相关。18三体综合征：也叫“爱德华兹综合征”，13三体综合征：又叫“PATAU综合征”。大部分具有这种核型的个体会在胚胎期流产，少数存活的患儿也往往具有智力障碍、生长发育障碍、多发畸形等。染色体的非整倍体异常，是无创产前检测（NIPT）的主要检测内容。

3. NIPT

无创产前检查，利用孕妇的外周血游离DNA（游离DNA指血浆中自然条件下已经片段化的DNA）检测胎儿是否存在染色体非整数倍异常。NIPT的理论基础是1997年卢煜明教授在怀有男胎的孕妇血浆中分离出Y染色体片段，因此孕妇血浆中包含胎儿游离DNA。

与以创伤性诊断方法为主的具有一定流产风险的产前诊断相比，包括孕早期的绒毛穿刺，孕中期的羊水穿刺和孕晚期的脐带穿刺等，NIPT的优势在于无创，减少不必要的穿刺，缓解产前诊断实验室压力，减少因穿刺而导致的流产，减少孕妇焦虑，减少漏诊等。

二、NIPT生信分析方法

1. NIPT 生信分析

NIPT生信分析方法分为：基于z-score、normalized chromosome value、genome-wide normalized respective chromosome等方法。本文将基于z-score方法作详细介绍。

Normalized chromosome value (Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D et al: Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. ) 与z-score 类似，但计算z值数值使用不同的normalized 方法，使用代表性的参考染色体比对条数作为分母计算比例，如选择9号染色体作为计算21号染色体的参考分母。目的是避免z-score依赖比对序列条数带来的波动。
genome-wide normalized respective chromosome (Yeang CH, Ma GC, Hsu HW et al: Genome-wide normalized score: a novel algorithm to detect fetal trisomy 21 during non-invasive prenatal testing. ) 使用染色体长度对染色体比对条数比例chrN%进行normalized。
z-score: 使用染色体比对条数比例chrN%、正常样本构建的参考分布参数、计算Z值，与正常样本构建的参考偏离程度大的，即|Z|>3，则认为发生非整倍体异常。基本方法：序列质量控制、比对、统计比对到各染色体上的序列数、与建立的整倍体参考分布对比获取z-score。后续研究内容，围绕Z值方法的优化进行，即使用GC校正后的比对计数提高灵敏度，优化高Z值假阳性，准确统计胎儿浓度以及对应的可靠测序数据量等。

2. z-score 相关阅读文献

（2008）Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. 首次提出Z-score的检测方法，并且分析CV、GC含量对Z值判别准确性的影响。

根据GC含量将染色体分为5组，从1组到5组GC含量逐渐增高。2组、3组的CV最低，预示着21、18的Z值检测判别方法较1组里的13染色体判别准确。

（2011）Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing. 对早前2008年z-score检测方法，针对13、18染色体的z值方法改进：使用GC校正后序列数进行Z值判别。

（2010）Sensitivity of Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Aneuploidy from Maternal Plasma Using Shotgun Sequencing Is Limited Only by Counting Statistics. 施加权重的方法进行GC校正。提出：灵敏度仅受测序序列数限制，只需对更多的DNA分子进行测序，就可以将含有任意小部分胎儿DNA的样品的灵敏度提高到任意精度。

（2012）Summarizing and correcting the GC content bias in high-throughput sequencing. 提出一种更有效的GC校正方法。

（2012）Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies. 华大基因NIFTY：用概率替代z值作为常染色体、性染色体、性别的判断。

（2014）Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing. 博奥NIPT：3步GC校正法（LOESS回归、同run间样本归一化、不同run间线性回归）

（2015）Noninvasive prenatal testing using a novel analysis pipeline to screen for all autosomal fetal aneuploidies improves pregnancy management. 区分了胎儿三体性引起的高 z 评分与母体局部 CNV 引起假阳性引起的高 Z 评分：除了使用z-score（染色体水平z值），还增加了zz-score（常染色体与剩余染色体的z值比较）、BM（常染色体内局部区域的Z值中位数）、OM（剩余常染色体内局部区域的Z值中位数）。

三、NIPT研究内容

NIPT 目前研究、优化的方向、内容有：

GC 校正和比对基因组区域筛选降低噪音。
不同胎儿DNA浓度下所需的测序数据量。
男性、女性胎儿DNA浓度估算。
性染色体异常检测。
母源CNV导致的假阳、嵌合体识别。

合木千行生信团队，具有NIPT分析服务能力，使用Z-score方法，沿袭多篇文章GC校正和基因组区域筛选经验，并且使用类似zz-score、BM、OM参数，区分母体局部CNV的假阳，具有极高检测灵敏度和特异性。

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