710033)

收稿日期

:

2006

2

09

2

12

;

接受日期

:

2006

2

10

2

11

基金项目

:

国家自然科学基金

(

30271281;

30170923

)

通讯作者

:

赵青川

.

Te:

l

(

029)

84773784

Em

ai:

l

z

haoqc

@

f

m

mu.

edu

.

cn

作者简介

:

蔡

磊

.

硕

士

生

(

导

师

赵

青

川

).

Te:

l

(

029

)

84771094

Ema

i

:

l

ori

en

ts

wift

@

yahoo

.

co

m

.

cn

=

摘

要

>

多种因素导

致的基

因差异

性表达

与疾病

的发

生发

展密切有关

,

分离差异表达基因

,

对于研

究细胞生命过

程的调

节机制及致病机制具

有重要意义

.

20

世纪

90

年代以来

,

先后

出现了

mRN

A

差异

显示

PCR

(

mRNA

DDRT

2

PCR

)

、

代表

性差

异分析

(

RD

A

)

、

抑制性消减杂交

(

SS

H

)

、

基因表达连续

性分析

(

SAGE)

和

D

NA

微阵列

(

DN

A

m

icroarray)

等

多种分

析差

别表

达基因的方法

.

我们

对以

上方法

的原

理、

基本

步骤

及其

应用

进行简要综述

.

=

关键词

>

mRNA

差异显示

;

基因表达

;

D

NA

微阵列

=

中图号

>

Q786

=

文献标识码

>

B

0

引言

随着各类基因组

计划的

相继完

成

,

人类

面临的

更艰

巨的

任务是研究基因功能

活动

,

也就

是说基

因组

序列分

析仅

仅代

表了遗传信息复杂性的一个层

次

,

而遗传信息

有序地、

时相地

表达则是决定

生物体

及其

行为的

另一

个层

次

.

所以

,

发

现不

同生物体及其组织在各种状态

下

(

正常状态、

发育、

衰老、

损伤

及疾病

)

差异表达的基因具有十分重要的意义

,

于是差异表达

基因筛选技术

应运而

生

.

目前

,

基因

表达

差异

的分

析通

常用

稳定状态下

mRN

A

的丰度高低及有无进行比

较

.

差异

表达基

因有两个含义

,

即表达基因的种类变化和基因

表达量的变

化

.

传统的基因分析方法

如

Northe

rn

杂交、

斑点杂交

等存在费

时、

费力的缺点

,

已不适宜进行大规模基因表达分

析研究的需

要

.

因此随着分子生物学的发展

,

出现了大量新方

法

,

按其

技术特

点可分为

三类

:

¹以杂

交

为基

础

的

技

术

,

包

括

Northern

b

l

ot

2

ti

ng

,

Sl

2

mapp

i

ng/R

nase

保护、

抑

制性消减杂交和

D

NA

微阵

列

;

º以

PCR

为基础的技术

,

如差异显示

PCR

(

DD

2

PCR

)

、

代表性

差异分析

(

RDA);

»以测

序为

基础

的技

术

,

如表

达序

列标

签

(

ES

T)

、

基因表达连续性分

析

(

SAGE)

等

.

我们对

目前主

要的

差异表达基因的筛选

方法作一综述

.

1

m

RNA

差

异

显

示

PCR

(

differ

en

tia

l

d

isp

l

a

y

P

CR,

DD

2

PCR

)

mRNA

差异显示

PCR

又

称

为差

别

显示

反转

录

PCR

(

d

if

2

ferential

d

i

sp

l

ay

reve

rse

transcr

i

pti

on

PCR,

DD

RT

2

PCR

).

DD

RT

2

PCR

技术

[

1-

3]

最早

于

1992

年出现

,

可以用于分离

在不同的真

核细胞中差异表达的

cD

NA

并加以

克隆

.

其原理

是将两

种细

胞的

mRNA

逆转录后进行

PCR

扩增

.

PCR

3

c

端引物序列是针

对

mRNA

的

pol

y(

A)

尾

设计的

,

一

般是

11

个

T

再加上

两个碱

基

,

这

样

12

种

3

c

端

引

物

(

T11AA

,

T11

AC

,

T11AG

,

T11

AT

,

T11CA

,

T11

GA

,

T11CC

,

T11CG

,

T11CT

,

T11GC

,

T11GG

,

T

T11GT)

就可以与所有

mRN

A

的

poly(

A)

尾匹

配

;

5

c

端引物

是

随机引物

,

一般为

10

个碱基

,

因此产生

一些不同长度的

c

DNA

片段

,

电泳后比较两者的

差别而得

到差异

表达基

因的

cD

NA

.

但这个方法存在许多

严重的

缺陷

,

它的

5

c

端随

机引

物一般

常

有

2~

3

个碱基不能与

cD

NA

模板

完全匹配

,

而且

PCR

反应中

随机性、

偶

然性比较大

,

容易形成非特异性扩

增而造成高

的假

阳性率

,

这就使下游

的筛选

工作

很巨大

.

理

论上

此方

法可

以

检测到

95

%

以上的转录体

,

但由于

引物序

列的随

机性和

竞争

性模板结合位点的存在

,

很难确定

实际的

原始

RNA

丰度

.

尽

管有上述缺陷

,

但由于其实验步骤较简单

,

此

方法在实际

工作

中应用仍较多

,

例如用于筛选在肿瘤发生、

愈

伤过程以及

胚胎

植入过程中起重要作用的基因等

.

2

代

表

性

差

异

分

析

(

r

ep

r

esen

ta

tiona

l

differ

en

ce

ana

lysis

,

R

DA)

RDA

[

4-

8]

是

L

i

sitsy

n

等于

l993

年在

差减杂

交的

技术基

础

上发展的

分析基

因组

D

NA

差异

的方法

,

H

ubank

等于

l994

年

对其作改良

后

用于

cD

NA

的

分析

.

该

技

术

是将

差

减杂

交

与

PCR

有机结合形成的一

种方

法

[

9]

,

主

要步

骤包

括

:

¹将对

照

组

(

dr

i

ver)

和待测组

(

tester)

mRNA

逆转录成

cD

NA

片段群

,

接

上接头进行第

1

次

PCR

扩增

;

º将

tester

cD

NA

和

dr

i

ver

c

DNA

用限制性内切酶酶切

,

形

成平均

长度

256bp

的

c

DNA

;

»将

接

头消化

,

在

tester

cD

NA

末

端

接

上

新

的

接

头

,

tester

cD

NA

和

driver

c

DNA

按

1

B

100

比例混合

.

过量的

diver

cDN

A

可与

tester

cDN

A

中互补的部分形成

双链

;

¼复性

,

以新

接头为

引物进

行

第

2

轮

PCR.

三种杂合体中只有

自身退

火形成

的

tester/

tester

杂合体才能和引物配对

,

并以指数形式扩增

;

tester

/driver

杂合

体只能是线性递增

;

而

driver

/driver

杂合体

则无法扩

增

.

该方

法的主要优点就是能

够使差

异表达

的基因

高度

富集

,

重复

性

较好

,

假阳性少

.

利用

RD

A

人们

已经发现

了多

个新

基因

.

如

白血病凋亡相关基

因

TFAR19

,

人

乳腺癌

相关

基因

TSPS0

等

.

Arava

等

[

10]

利用

RDA

分

析了

胰腺

B

2

细胞

和

A

2

细

胞

,

发现

26

个基因在

B

2

细胞中高表达

,

其中

l

4

个为已

知基因

,

如

PKA

调

节亚基、

ST

AT6

等

,

其余

为未知

基因

,

阐明

这些未知

基因的

作

用对于了解

B

2

细胞的功能及

1

型糖尿病的发病机制具有重要

意义

.

3

抑

制

性消

减

杂交

(

s

uppr

ession

s

ub

tr

a

ctive

hybr

i

d

iza

t

i

on

,

SSH

)

由于

RDA

或

D

D

2

PCR

在显示低丰度

mRNA

上

存在困难

,

且需多轮

PCR

才能完成

.

D

iatchenko

等在

差减

cD

NA

和

RDA

的基础上发展了一种

基于

PCR

的

SS

H

[

11-

14]

(

suppressio

n

sub

2

tracti

ve

H

ybridizatio

n

,

SS

H

).

该

方法

同样

先将

tester

与

dr

i

ver

的

c

DNA

用限制性酶

消化

,

但

整个方

法仅

用两轮

杂交

和

PCR

扩增可完成

.

其主要步骤为

:

¹

tester

c

DNA

与

driver

cD

NA

分

286

第四军医大学学报

(

J

F

ourt

h

M

ilM

ed

Un

i

v)

2007

,

28(

3)

http

:

/

/

jo

urna.

l

f

m

m

u

.

edu

.