应学生及个别博友的要求，尽管专业博文点击率和反应均很差，但在去San Diego参加PAG会议之前，还是抽时间给出【R高级教程】的第二专题。专题一给出了聚类分析的示例，本专题主要谈在表达谱芯片分析中如何利用Bioconductor鉴定差异表达基因。

鉴定差异表达基因是表达谱芯片分析pipeline中必须的分析步骤。差异表达基因分析是根据表型协变量(分类变量)鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤(在机器学习框架下属于非监督性分类)，因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。

鉴定差异表达基因是表达谱芯片分析pipeline中必须的分析步骤。差异表达基因分析是根据表型协变量(分类变量)鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤(在机器学习框架下属于非监督性分类)，因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。

本专题示例依然来自GEO数据库中检索号为GSE11787 的Affymetrix芯片的数据，数据介绍参阅专题一。>library(limma)

>design

这个是根据芯片试验设计，对表型协变量的水平进行design，比如本例中共有6张芯片，前3张为control对照组，后3张芯片为实验处理组，用1表示对照组，用2表示处理组。其他试验设计同理，比如2*2的因子设计试验，如果每个水平技术重复3次，那么可以表示为：design colnames(design)

>fit

>contrast.matrix

>fit

>fit2

>fit2

>results

>summary(results)

>vennCounts(results)

>vennDiagram(results)

比较遗憾的是，目前limma自带的venn作图函数不能做超过3维的高维venn图，只能画出3个圆圈的venn图，即只能同时对三个coef进行venn作图。上面的venn图只有一个coef，太简单了。下面是一个由本实验室芯片数据得出的三个coef的venn图例：

>heatDiagram(results,fit2$coef)

红色为control中(与LPS相比)的高表达基因，绿色为control中(与LPS相比)的低表达基因，x轴的数字表示差异表达基因在eset2中所处的位置。>x

>write.table(x, file="limma.xls", row.names=F, sep="\t")

将结果写入limma.xls文件中，内容包括AveExpr值(比较组间绝对值的平均差异值)、logFC值(差异倍数)、t值、P值、q值(即adj.P.Val值)和B值。一般logFC值、P值、q值和AveExpr值用来作为差异表达的判断标准，比如差异倍数在2倍以上、绝对差异表达在10以上、P值小于0.01等。在Excel文件中，根据各项判断标准排序，可以很容易地得到差异表达基因列表，这个列表可以用来进行后续的分析，如GO注释、基因网络绘制等。

专题一中提到实际研究中，一般只用差异表达基因进行聚类分析，在R中，根据差异表达结果过滤表达值很简单(具体的值可以依据芯片数据的实际情况设定，比如P值可以设宽松点0.05、logFC的绝对值也可设为1或2、绝对表达差异也可设低一点，如6或8这样的值)：>y 1.5 | xlogFC < -1.5& xAveExpr > 10),]

>length(yID)>eset3

经过上面P值、表达倍数差异和绝对差异的过滤，eset3中就只包含差异表达基因了，这样eset3可用来进行聚类分析了。