成像系统（一）：吲哚菁绿荧光成像在外科手术中的应用

1. Introduction导言
- 1.1 Indocyanine Green Angiography吲哚青绿血管造影
- 1.2 Related Work相关工作
- 1.3 ICG出版物
2. Properties of Indocyanine Green吲哚菁绿的性质
- 2.1 Structure and Stability 结构和稳定性
- - 2.1.1 Spectral Stability 光谱稳定性
  - 2.1.2 Photochemical Stability 光化学稳定性
  - 2.1.3 蛋白质结合和荧光寿命。
  - - 2.2 生理学和药代动力学。
    - 2.3 渗透。
- 2.4 ICG衍生物和类ICG造影剂。
3. Instrumentation仪器仪表
- 3.1 荧光成像。
- 3.2 ICGA设备设计的例子
- - 3.2.1 光源
  - 3.2.2 相机
4. Surgical Applications
5. Conclusions
附件：略缩语

1. Introduction导言

在体外和体内细胞和组织的可视化方面，荧光成像（FI，Fluorescence Imaging）是生物医学科学中最流行的成像模式之一。
它的优点包括：

高对比度，即信噪比（SNR）：由于使用不同的波长分别用于照明和记录（参见图4），只有目标是可见的，而背景是不可见的;
高灵敏度：即使极小的浓度也可以被看到;
给出分子层级的信息：使一些组织的（生物）化学信息在空间和时间上可见;
是一种优越的研究工具：具有多种成像方式，大多数是独立的；
便宜：所需的光学仪器非常简单，数据处理规模与计算消耗不大;
易于使用：类似于经典染色。

以吲哚菁绿（ICG）成像为代表的荧光成像是一种相对新颖的成像方法，因此仍在以多种方式发展。ICG已经在一些临床应用中常规使用了近60年，其在相关领域中的应用的是众所周知的，这极大地促进了其引入新应用。从工程的角度来看，图像和视频处理似乎是ICG成像（ICGI）最具发展潜力的领域之一，例如，用于分析icg荧光动力学（参见图2）。
这意味着，对于推动各种新兴的基于icg的医学成像方法在临床中的应用，仍有大量的计算开发工作需要去做。

1.1 Indocyanine Green Angiography吲哚青绿血管造影

吲哚菁绿应用于视网膜血管造影长达数十年。然而，在可视光范围内的荧光素在视网膜血管造影中更受欢迎，很大一部分原因是它在没有任何电子照相机的情况下可见。然而，使用荧光素和icg在视网膜层上成像的对象有些不同。ICG提供了关于深层静脉的信息，因为它在近红外（NIR）中工作，在近红外（NIR）中生物组织比在可见光波长中更透明。

【图1】典型的ICGA图像：大鼠心脏。冠状动脉清晰可见。肝脏在右边发光。在放大20倍的显微镜下得到这幅图片.由在Huch的Outi Villet博士使用图6所示的显微镜装置拍摄这幅图像。

ICG血管造影术（ICGA）的荧光成像原理很简单：用激发波长（约750到800nm）的光照射感兴趣的组织，同时在更长的发射波长（超过800nm;图4）观察它。为了创造一个简单的ICGA设备，除了合适的相机和光源之外，只需要几个滤光器，它们可以非常小并且甚至适合便携式使用。需要滤波器以防止激发（强）和荧光（弱）光线在传感器处的混合。即使荧光仅是激发强度的一小部分（表9：第1行与第10行），也可获得令人惊讶的良好信噪比（snr）：一个明亮的荧光物体，主要是含有ICG的血管，可以在几乎黑色的背景上清晰可见（见图1）。没有滤光器，在激发光的强反射中看不到弱荧光图像。吲哚菁绿染料是由柯达研究实验室于1955年开发用于近红外（nir）摄影，并于1956年批准用于临床。然而，十年后，ICG才被用于血管造影。ICG从70年代初开始被用于视网膜血管造影。

1.2 Related Work相关工作

见论文

1.3 ICG出版物

大多数关于ICG的研究似乎与临床科学有关，而不是与工程学，光学，光谱学或成像有关，这表明ICG在很多领域的具有很大的发展空间。例如，大多数关于图像处理的工作仅涉及视网膜的ICGA。ICG在一些临床应用中的长期和常规使用，例如视网膜成像，为我们提供了许多宝贵的知识和经验，这些知识和经验可用于开发新的临床应用，预计这些应用将非常迅速地引入同时风险和成本相对较低。

2. Properties of Indocyanine Green吲哚菁绿的性质

ICG被快速接受的主要优点是吸收约800 nm的光波，通过与血浆蛋白结合对血管隔室的限制，低毒性，并迅速排泄，几乎完全进入胆汁。
ICG发出约800nm和更长波长的荧光。光谱的确切形状在某种程度上取决于ICG分子的化学环境和物理条件，如温度和icg浓度。光谱也是平滑变化的，因此文献中给出的确切波长值也会根据激发光谱和所用滤光器而有所不同。
荧光光谱对分子环境的敏感性意味着ICG是一种潜在的分子探针。这尚未用于临床应用。这显然是ICG成像发展的一个潜在方向。与此方向相关的是需要更好地理解ICG分子在不同细胞和组织中的结合。这显然是使用荧光显微镜进行一些进一步系统性基础研究的舞台，后来可能甚至可能导致生物医学应用中的一些主要成像创新。
ICG具有几种临床上优异的性质，在其长期临床应用中已得到彻底验证：
（i）患者安全：无毒和非电离；
（ii）血管造影的理想选择：有效结合血脂蛋白，即不会从血液循环中泄漏；
（iii）在血液循环中寿命较短，允许重复应用；
（iv）良好的SNR：组织中没有太多近红外自发荧光，给出低噪声背景；
（v）深度成像：在组织光学窗口（近红外）中操作；
（vi）简单廉价的成像设备；
最近推出了关于ICG的新的成功医疗应用，主要是外科手术。 icg的一些优秀特性为研究和工程开发提供了进一步的挑战：
（i）ICG在癌症治疗，重建手术，甚至胆囊切除术等许多应用中都是最新的，
（ii）ICG需要一些NIR成像装置才能看到，
（iii）对于某些应用，ICG似乎需要在线照明控制设施，
（iv）临床上可用的化学衍生物用于更具体的物理化学成像尚不存在，
（v）ICG注射溶液含有一些碘化钠; 因此，某些患者可能会有过敏反应，
（vi）ICG在溶液中（10小时）和暴露于光时不稳定，并且
（vii）ICG荧光量子产额随浓度非线性变化
在一些实验室正在进行开发工作以创造更好的近红外造影剂。一些提出基于ICG的新分子，而也有完全不同的方法，如基于量子点的造影剂。

2.1 Structure and Stability 结构和稳定性

吲哚菁绿是一种分子量为751.4的三羰花青染料。它是一种带负电荷的离子，属于大型花青染料家族。干燥的ICG在室温下稳定。这也是药学上可用的ICG的形式。ICG可溶于水（1mg / ml），但不易溶于盐水。因此，当需要等渗溶液时，首先应将icg溶解在水中，然后用盐水稀释（σ-醛）。一些化学物质，如聚天冬氨酸钠（pasp），可用于稳定水和血液中的ICG，例如，当血液样本应储存数天。对于大鼠模型，也已证实可以在体内使用pasp。ICG的化学分解可以通过叠氮化钠NaN3（单线态氧的猝灭剂，即抗氧化剂）来抑制。 ICG溶液在低温（4℃）下的储存也会抑制分解，而在室温下储存会促进分解。

2.1.1 Spectral Stability 光谱稳定性

在水溶液中，ICG分子倾向于聚集，这会影响它们的光学性质。聚集取决于浓度和时间;因此，ICG解决方案不遵循Lambert-Beer定律高于15 mg / L的血浆。当ICG溶解在蒸馏水中时，光谱稳定性最快，因此当快速光谱稳定性至关重要时，例如，当ICG用于定量目的时，Landsman等人。不建议在注射液中加入等渗盐水和/或白蛋白。在组织和细胞中，由于与细胞蛋白结合，NIR吸收峰移动到更长的波长（810nm）。

2.1.2 Photochemical Stability 光化学稳定性

当受到激发时，ICG会产生单线态氧，这是一种强的细胞毒性物质。恩格尔等人。最近研究了暴露在光线下icg的稳定性以及icg单线态氧产生的后果。根据他们的观察，icg的分解是由于单线态氧，但似乎单线态氧立即与icg本身的分解产物结合。因此，似乎icg不是单线态氧的非常好的来源。这对临床应用有两个主要的影响：首先，可以使用icg而不必担心由于单线态氧产生的光毒性;其次，当icg用作光动力或光热剂时，其分解产物可能是光毒性的主要原因。分解产物进一步热分解成几种羰基化合物。然而，根据tokuda等人最近的一项研究，icg似乎对视网膜有些光毒性。
恩格尔等人测试了几种溶剂，用于光诱导的icg分解。血管造影应用的另一个有趣和令人鼓舞的是，发现血浆中的icg会分解，因此与水中的icg相比，只记录了少量的分解产物。他们认为产生的单线态氧被一些血浆蛋白淬灭，从而抑制了单线态氧的icg分解。最近佐藤等人。通过对培养的Muller细胞进行长波长滤波，研究了宽带光对ICG毒性的影响。根据他们的观察，过滤可以防止光毒性。

2.1.3 蛋白质结合和荧光寿命。

与血浆蛋白特别是脂蛋白快速结合的重要特性使ICG在手术中的重复应用成为可能。与血浆蛋白的结合似乎不会改变蛋白质结构，这是无毒性的一个标志。似乎ICG实际上与脂蛋白复合物（β-脂蛋白）的脂质结合，这种结合比ICG结合自由胆固醇产生更强烈的荧光。与血液蛋白质的结合也会缓慢地移动几分钟，吸收峰值在780 nm处向更长的波长移动到805 nm。在表皮细胞培养物中在810nm观察到最大吸收峰，在体内人体皮肤中观察到805-810nm处的吸收峰最大值。发射峰也同样地移动。光谱的形状和荧光寿命的变化都会受到化学环境的影响，这一事实可用于探测ICG和类似染料的分子环境。

2.2 生理学和药代动力学。

icg没有任何已知的代谢产物，它被肝脏快速提取到胆汁中。通过称为谷胱甘肽s-转移酶的蛋白质进行转运而不进行修饰。在低剂量（0.5mg / kg）下，热量限制似乎显着增加血浆清除率。不同肝脏疾病的蛋白质谱也影响血液中的icg蛋白结合。 reekers等。提供了最近对身体状况i-ii患者的血浆消失率的研究。
用于体内视网膜和脉络膜血管造影的典型染料浓度在通过注射到外周臂静脉中施用的20-25mg / ml icg的范围内。对于肝功能的研究，静脉注射剂量基于0.5mg / kg体重计算。在心输出量和血容量监测中，注射的染料总剂量应保持在2 mg / kg以下。在高剂量5mg / kg体重的人中未观察到显着的毒性作用。表3简要概述了使用icg进行的毒性研究。

2.3 渗透。

ICG在所谓的组织光学窗口中工作，即，在激发和荧光中使用的NIR光穿透组织几毫米甚至更远。这种半透明性有助于观察，例如，可能埋在凝块或硬脑膜中的血管结构。光能进入皮肤和下层组织的渗透深度可以根据光密度od的体内测量来计算（会计散射和吸收））定义为od = log10i0 / it的人体皮肤和下层组织，其中i0是测量的背反射强度，它是参考的反射强度。在775,807和827nm对12名健康年轻受试者进行的这种测量给出了3mm皮下脂肪层的以下依赖性：od775 = 3.2; od807 = 2.4; od827 = 1.6。低吸收和高散射允许由于光子再循环效应而提供对皮肤组织的平滑且强烈的深度照射。

2.4 ICG衍生物和类ICG造影剂。

虽然近红外荧光（NIRF）成像具有公认的潜力，但只有ICG是临床认可的NIRF染料。也许在未来会有更多的NIRF染料。至少在开发新的NIRF染料方面的工作一直在进行，并且已经引入了几种潜在的nirf染料候选物。在这里，我们将简要回顾一下icg衍生品的最新发展。
虽然icg与血液中的脂蛋白迅速结合，但将icg与脂蛋白纳米粒子结合是很自然的[66]。脂质纳米颗粒和胶束已掺杂有icg。 ogawa等。已经将icg与几种抗体结合，以便将icg靶向癌细胞。然而，与蛋白质结合的icg通常显着地失去其荧光。因此，为了具有高荧光效率，应该解离icg-抗体复合物，使得icg可以用作体内分子成像探针。秒。 achilefu的小组最近将icg与叶酸 - 聚乙二醇结合用于肿瘤靶向。艾伯特等人。他们将icg的药代动力学与其称为sidag的亲水衍生物与用于乳腺癌成像的小鼠模型进行了比较。
已经使用icg实现了几个封装。 makino等。用icg标记了乳糖体。发现标记的乳糖体在血液循环中是稳定的并且在小鼠模型肝肿瘤部位逐渐累积。巴特等人。已经设计了磷酸钙钙复合纳米粒子嵌入icg用于靶向人类乳腺癌和胰腺癌。
次氰酸绿（ifcg）（法国巴黎的laboratoires serb）也称为ifc绿，是不含碘的icg。据认为，IFCG在黄斑应用中的细胞毒性较小，因为5%的葡萄糖溶液代替纯水作为其溶剂。根据[56]，IFCG对视网膜细胞的毒性小于ICG的10倍。次青绿用于黄斑皱褶手术的研究。在[82]中比较了商用ICG和IFCG产品在几种溶剂和浓度下的吸收和发射光谱。

3. Instrumentation仪器仪表

在本节中，将给出从仪器工程角度对icg成像的概述。吲哚菁绿成像属于光学荧光成像类。相应地，当与手术显微镜一起使用时，它非常类似于荧光显微镜。因此，所需的仪器与一般的荧光成像或特别是荧光显微镜相似或甚至完全相同。

3.1 荧光成像。

通常，荧光显微镜是这样做的：可见光或激发光和荧光图像一起显示为一个图像。单独的荧光图像可以仅包含一些细节，因此可见图像借助于在可见图像中看到的界标有助于定位荧光部分的位置。通常，荧光通道以鲜艳的绿色显示和呈现，与组织的可见图像具有鲜明的颜色对比。这种可视化在术中使用中尤为重要，其中荧光部分如血管应该容易且立即被识别。为了能够组合这两个图像，它们应该被正确地对准，这被称为图像配准，并且它通常是计算上硬的图像处理操作，而用于显示的两个图像的渲染是简单的操作。
然而，使用普通分束器的光学装置可以完全避免图像配准问题，该分束器是二向色分光镜并将光束分离、过滤为两部分：一部分用于可见摄像机，另一部分用于近红外摄像机。这意味着两个摄像机看到完全相同的视野（fov），并且不需要注册，前提是摄像机具有相同的光学系统并且相对于彼此正确定位。除了分束器之外，嵌入在光学器件中或在单独的滤光片立方体中的合适的可更换滤光器（这是荧光显微镜中通常的布置）被用在相机前面以阻挡不需要的波长进入传感器。对于近红外相机来说，滤光器尤为重要，它使得激发光不与荧光信号混合，因为两者在传感器处相加在所得电子图像中是不可分离的。可见光范围内的相机通常已经包含阻挡大部分近红外辐射的滤光器，否则这些滤光器将在不同程度上与视觉图像的不同RGB通道相加，从而扭曲其感知颜色。传统荧光显微镜和使用分束器进行ICG荧光成像的操作显微镜之间的主要区别在于，荧光显微镜中通过分束器完成的照明被普通彩色相机取代，而照明可以通过外部光源完成。激发光不应含有荧光波长，它们应仅来自发荧光的ICG。因此，当使用广谱光源时，需要滤光器来阻挡来自发射的激发光的更长波长。理想情况下，两个滤波器应将频谱划分为两个非重叠频段（图3）。这可以使用干涉滤光器对来完成，干涉滤光器对可以针对任何波长范围进行定制，并且可以具有非常窄的过渡带。商用干涉滤光片对也可用于icg荧光，将光谱分离到约800 nm（色度技术，brattleboro，vt，usa）（见图3）。当使用具有窄光谱的光源，激光器时，不需要使用任何激发光滤光器。分束器的使用是解决具有挑战性的图像配准问题的一种特别简单和实用的方法，它可以使彩色图像和ICGA的说明性混合易于在线完成，这对于关键的术中使用至关重要。（表4）。

图3:ICG滤波器对（fs：源高通滤波器；fc：相机低通滤波器（屏障））的传输和两个NIR LED的发射光谱，其标称峰值波长为780和850 nm，最大半带宽（fhm）下的全宽相应地为30和95 nm。

3.2 ICGA设备设计的例子

在本节中，我们原则上将设计一个简单的ICGA设备。荧光成像的原理在图4中给出，以便看到仅具有激发光强度的一小部分的荧光，后者不应包含任何荧光波长。如果使用宽带光源，如卤素灯，应该有一个滤波器来切割更长的波长（fs）。在使用单色激光器的情况下，通常不需要滤光器。在摄像机侧总是需要互补滤波，即激发波长，并且可能切断较短波长（fc）。从表5中可以看出，在选择精确的滤波器波长时有一些自由度。除了滤波器波长，我们还应该考虑光源，滤波器和相机的波长依赖性。在理想情况下，相机不记录激发光，同时尽可能记录荧光。这显然是一个双目标优化问题：最小化激发光泄漏同时最大化记录的荧光。使这成为一个重要的技术问题的是所需的每个组件的光谱形状以及影响记录的组件的其他性质。例如，当波长时，基于硅半导体的图像传感器的量子效率通常强烈地降低。增加。量子效率是指实际记录的撞击传感器的光子部分。对于硅传感器，其在可见波长中通常约为70％，而对于约700-900nm的NIR波长，其可在50％至10％或甚至更低的范围内（图5）。

图4：荧光成像的原理。来自光源的辐射通过高通滤波器fs滤波，以去除荧光波长。组织下的血液和icg悬浮液吸收激发波长并在荧光带中发射。传感器通过低通滤波器fc接收发射的光，以去除从光源反射的激发光。

3.2.1 光源

表6描述了可用于荧光成像的光源的基本特性。正如我们在表5中看到的，所有基本光源类型已经在一些现有的ICGA实现中使用。最常见的是LED和卤素灯用于照明。在一些实验中，还使用了激光器，主要是半导体二极管激光器，类似于LED。在这个例子中，我们将仔细观察LED。 LED灯不是完全单色的，而是包含通常具有钟形光谱的波长（图3），它不应与相机滤光片光谱（fc）重叠太多（图3）。如果记录或观察到视觉图像，我们自然需要白光源。请注意，大多数显微镜灯至少部分地滤除了NIR波长。图3显示了标称（峰值）波长为780nm的led的光谱（led 780-66-60，roithner lasertechnik gmbh，vienna，austria）。用hr4000分光光度计（ocean optics，dunedin，fl，usa）进行测量。可以看出，波长范围超过100纳米，带宽为30纳米（fwhm）。

3.2.2 相机

原则上，每个ccd或cmos相机都能记录nir。但是，大多数相机都是通过切割nir波长的滤镜来防止这样做的，否则叠加的nir图像会严重干扰视觉图像。相机传感器最重要的参数是分辨率，信噪比（snr）和量子效率。影响snr的参数是adc转换器的分辨率，读取噪声，暗电流和传感器的量子阱深度。表7和表8中列出了一些选定传感器的这些参数：mt9p031和mt9v032（aptina imaging，san jose，ca，usa）是典型的互补金属氧化物半导体（cmos）传感器，不同之处在于增强了后者的nir响应。机器视觉相机，elphel nc353l（elphel inc。西谷市，犹他州，美国）包括mt9p031传感器。 kai-11002（柯达，纽约，美国）是典型的电荷耦合器件（ccd）传感器。 ixon3和neo传感器（andor technology plc，belfast，北爱尔兰）适用于需要高灵敏度的科学成像。 ixon3基于电子倍增器ccd（em-ccd）技术，而neo基于科学cmos（scmos）传感器。 fl-280和er-150是来自hamamatsu（hamamatsu photonics k.k，shizuoka，japan）的相应的scmos和ccd传感器。
虽然几乎所有的硅基相机对近红外都有些敏感，但当它们没有阻挡nir波长的滤波器时，不幸的是，量子效率往往会通过增加波长而迅速减小（图5）。在设计icg成像时，这种量子效率的降低是一个必不可少的问题，因为荧光峰非常宽并且远远超过800nm，效率非常低。因此，光源和滤光片的标称波长应尽可能短，这与激发和荧光的良好分离以及icg的吸收最大值应接近激发光的标称波长这一事实相矛盾。资源。 icg的量子效率很低，在水中约为0.3％，在血液中约为1.2％。这限制了相机灵敏度，尤其是在视频应用中。冷却的ccds通常用于增加信噪比（参见表5）。有时，图像增强器（夜视）用于增加视频记录的灵敏度，并允许低剂量的icg（微剂量）。

4. Surgical Applications

5. Conclusions

我们已经回顾了200多篇论文，描述了荧光造影剂吲哚青绿在临床上的开发和应用，主要是手术，应用。由于空间限制，许多有趣的作品不得不省略。然而，希望我们成功地收集了大部分主要出版物，概述了吲哚菁绿荧光技术及其最重要的新兴临床应用。
ICG和ICG血管造影的许多新的临床应用刚刚出现，并且肯定会在不久的将来出现更多; 因此，显然还需要更多的研究才能充分发挥这种相对简单的光学技术的所有潜力。进一步工程研究的明显领域包括
（i）ICG和ICGA信息的图像处理，也包括实时的（视频和立体声），
（ii）毛细血管循环监测和灌注动力学成像，
（iii）将ICG和其他成像方式结合，如可见光，ct，mri和宠物[263-266]，
（iv）将icg和icga与真皮成像方法相结合，
（v）更深层成像（光学层析成像），
（vi）光学成像设备开发（腹腔镜检查）和优化，自动化，
（vii）为更具体的成像模式开发新的ICG衍生物，
（viii）提高ICG的量子效率例如，金属纳米颗粒，
（ix）ICG的微纳米封装用于非血管造影应用，
（x）提取光谱信息和化学计量学（多光谱成像）[273]，以及
（xi）ICG成像与机器人辅助手术的整合[274]。
在临床环境中，ICG是一种新的独特的淋巴循环系统成像方法，因此提供了全新临床应用的挑战和潜力

附件：略缩语

缩略语
3D：立体
ALT：股前外侧皮瓣
ASA：美国麻醉学会病人分类状态
AVM：动静脉畸形
BP：血压
BSA：牛血清白蛋白
BSS：平衡盐溶液
CABG：冠状动脉旁路移植术
CCD：电荷耦合器件（相机）
CEA：颈动脉末端动脉切除术
DSA：数字减影血管造影
EPR：增强渗透性和保留性
FDA :(美国）食品和药品管理局
FLIM：荧光寿命成像显微镜
FOV：视场FT荧光断层扫描
HDL：高密度脂蛋白
HAS：人血清白蛋白
HUCH：赫尔辛基大学中心医院
ICA：独立成分分析
ICCD：图像增强型CCD
ICG：吲哚菁绿
ICG-PDR：ICG血浆消失率
ICG-VA：ICG视频血管造影
ICGA：ICG血管造影术
ICGI：ICG成像
ICG-PDR：ICG血浆消失率
ICU：重症监护病房
IfCG：Infracyanine green
IREE：红外线电子内窥镜
ISPI：原位光免疫疗法
LAAA：光活化抗菌剂
LDL：低密度脂蛋白
LDPI：激光多普勒灌注成像
LED：发光二极管
LIFE：腹腔镜胃内全层厚度
切除
MICAD：分子成像和造影剂
数据库
MRI：磁共振成像
NILI：近红外激光照射
NIR：近红外线
NIRF：NIR荧光
NIRS：近红外光谱
NOTES：自然孔口经腔内窥镜手术
OCT：光学相干断层扫描
PAD：外周动脉疾病
PAOD：外周动脉闭塞性疾病
PASP：聚天冬氨酸钠
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PDT：光动力疗法
PPG：Photoplethysmography
PPT：光热疗法
PV：外周血管系统
PVD：PV疾病
QD：量子点
红细胞：红细胞
RGB：红绿蓝
RP：雷诺现象
RPE：视网膜色素上皮细胞
SLD：超辐射发光二极管
SLN：前哨淋巴结
SLNB：前哨淋巴结活检
SNNS：Sentinel节点导航手术
SNR：信噪比
TTFM：运输时间流量计。

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