TheraPEAK™ X-VIVO™ x-vivo™系列免疫细胞无血清培养基

免疫细胞在细胞和基因治疗中有着非常广泛的应用，无血清培养基是免疫细胞培养中一个非常关键的环节。在整个过程中，免疫细胞培养基的安全性和一致性尤为重要，在短时间内获得高产量和高质量的效应细胞，成为细胞和基因治疗的重要步骤。基于此，Lonza开发了 X-VIVO系列免疫细胞无血清培养基产品。

X-VIV010无血清免疫aOHQiS养基

为LAK细胞在无血清环境传代而设计。可培养众多细胞：

•PBL、NK、LAK、T细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞；

•含重组人胰岛素、人转铁蛋白和白蛋白；

,蛋白浓度1000ug/mL

X-VIV015无血精免疫细胞培养基

支持由外周血和人肿瘤分离纯化的CD3+细胞的增殖，以及：

•PBL、DC、CIK、NK、LAK, TIL、T细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、

HUT-78和相关的人淋巴细胞细胞系；

•含重组人胰岛素、人转铁蛋白和白蛋白；

•蛋白浓度2000ug/mL

X-VIVO 20无dn清免疫细胸培养基

支持由外周血和人肿瘤分离纯化的CD3+细胞的增殖，以及：

•PBL、DC、CIK、NK、LAK、TIL、T细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、

HUT-78和相关的人淋巴细胞细胞系；

•含重组人胰岛素、人转铁蛋白和白蛋白；

•蛋白浓度2000ug/mL

所有X-VIVO系列培养基药物主文件已提交至FDA

Primary human CD4 and CD8 T cells were mixed at a 1:1 ratio, activated with CD3/28-coated beads, and cultured in RPMI, AIM V CTS and X-VIVO™ 15 with no serum (circles) and with serum (squares). The population doubling rate was measured by cell counting on the days indicated by a symbol. Error bars represent SEM.Adapted from Medvec R.et al.Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T cells by a Serum-Free Medium. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. Volume 8, P65-74. March 2018. https:// doi.org/10.1016/j.omtm.2017.11.001 ,CC BY 4.0.

为满足细胞治疗行业对于安全性和高标准生产的需要，LONZA公司的X-VIVO系列提供两种类型的培养基：所有的TheraPEAK™ X-VIVO™培养基均根据医疗器械法规(包括21 CFR Part 820 )进行生产，生产工厂已通过FDA的IS。13485认证质量管理体系注册。用于进一步生产用途的GMP配方不含抗生素、不含酚红, 均标记FFM (For Further Manufacture)o用于科研使用的培养基含抗生素和酚红，仅标记RUO(Research Use 0nly)。

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RUO和FFM两种类型IS养基的区別:

X-VIVO部分参考文献

Nature Biotechnology (2019). doi: 10.1038/s41587-019-0325-6

Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency. (聚合物稳定的Cas9纳米IR粒和修饰的修复模板可提高基因组编辑效率)

作者：Nguyen, D. N.1,2 , Roth, T. L.,2, et al.

单位：1.Department of Medicine, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA.

2.Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA.

IBS：我们报告了两个提高临床相关原代细胞类型中基于CRISPR-CAS9的基因组编辑效率的改进。添加在同源定向修复(HDR)模板末端的Cas9靶序列(TCTS)与Cas9核糖核蛋白(RNP)相互作用，将模板递送到细胞核，使 HDR效率提高约2-4倍。此外，使用聚谷氨酸将Cas9RNPs稳定为纳米颗粒，进一步将编辑效率提高了近两倍，降低了毒性，并使冻干储存不会失去活性。将这两项改进结合起来，即使在减少HDR模板剂量的情况下也可以提高基因编辑效率，在不同细胞类型的多个基因组位点产生大约两到六倍的活性编辑细胞，如CD3+ T细胞、CD8+T细胞、 CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、y 5T细胞、B细胞、自然杀伤细胞以及原代和诱导的多能干细胞衍生的造血干细胞。

简要试验方法：

细胞扩增：分离CD4+, CD8+, CD3+T细胞，调节性T细胞(CD4+ CD127|OW CD25+), y 5 T细胞，B细胞， NK细胞进行扩增。购买商业化CD34+造血干细胞进行扩增。

-T细胞培养基：X-VIVO 15, 5% FBS, 50卩M 2-統基乙醇,10 mM N-乙酰半胱氨酸，300 U/mL IL-2, 5 ng/ mL IL-7,和 5 ng/mL IL-15；

-B 细胞培养基：IMDM, 5% FBS, 100 ng/mL MEGACD40L, 1000 ng/mL CpG, 500 U/mL IL-2, 50 ng/mL IL- 10, 和 10 ng/ml IL-15；

-NK细胞培养基：X-VIVO 15, 5% FBS, 50卩M 2-疏基乙醇，10 mM N-乙酰半胱氨酸，300 U/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7,和 5 ng/mL IL-15；

转染：将HDR模板与RNPs混合并孵育至少5分钟，然后与细胞混合，利用Lonza 4D核转染系统96孔模块， P3核转染试剂盒，进行转染。

-T细胞，NK细胞，B细胞按照每个样本0.5-1 x伸个细胞进行电转，核转染条件EH-115；

-外周血来源CD34+造血干细

胞，核转染条件ER-100；

-IPS衍生的CD34+造血干细

胞，核转染条件EY-100。

转染后加入80ul培养基，孵育

10-20分钟，转移到培养体系中。

结论：PGA作为RNP纳米颗粒稳定增强剂和tCTS修饰的HDR模板，可以在多种原代免疫细胞中进行高百分比编辑，并提高了编辑后的细胞产量，从而为下一代过继细胞疗法打开了大门。

NK自然杀伤细胞

Nature Medicine (2019). doi: 10.1038/s41591 -019-0401 -y

CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NKcell infiltration and antitumor efficiency.

(携带CCL5的港瘤痫毒IS强CCR5工程的NK细胞展制和抗肿瘤效果)

作者：Feng Li1, et al.

单位：1 .Biotherapy Center, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450052, China

IBS:

背景：自然杀伤(NK)细胞具有很强的抗肿瘤活性。但大多数输入的NK细胞仍在外周血中循环，而不是进入肿瘤部位, 因此在实体瘤的治疗中取得的成功非常有限。趋化因子及其受体在NK细胞分布中起重要作用。增强免疫细胞表面趋化因子受体与肿瘤特异性趋化因子的匹配和驱动，可提高NK细胞的治疗效果。

方法：CCR5-CCL5轴是NK细胞归巢到肿瘤部位的关键。因此，我们分析了癌症患者和健康献血者NK细胞上 CCR5的表达。然后我们用慢病毒和溶瘤病毒分别上调NK细胞和肿瘤细胞中CCR5和CCL5的表达。还进行了动物实验，以检验溶瘤病毒与NK细胞联合的效果。

结果：在各种实体瘤患者和健康人NK细胞中，CCR5在体外扩增前后均呈低水平表达。CCR5基因工程的NK 细胞具有增强肿瘤浸润和抗肿瘤作用，但在体内肿瘤模型中没有观察到完全消退。为了进一步提高治疗效果，我们构建了表达CCL5的溶瘤痘苗病毒。体外实验结果表明，痘苗病毒能在肿瘤细胞中产生CCL5,而感染性不受影响。 CCL5修饰的痘苗病毒感染的肿瘤细胞上清液可促进CCR5过表达的NK细胞的定向运动，但不能促进对照组细胞的定向运动。更重要的是，NK细胞对痘苗病毒具有抵抗力，接触后其功能不受影响。体内实验表明，与原型病毒相比，表达CCL5的痘苗病毒可诱导更多的NK细胞聚集在肿瘤病灶内。

结论：增强匹配的趋化因子和趋化因子受体是提高NK细胞归巢和治疗效果的一种有前途的方法。表达特异性趋化因子的溶瘤痘苗病毒可以协同增强基于NK细胞的治疗效果。

小结：1 x106细胞/mLNK细胞悬浮在含5%热灭活FBS, 200U/mL IL-2, 10 ng/mL IL-15和1 X10&细胞/mL丝裂霉素处理的K562细胞的X-VIVO 10培养基中。扩增15d后，NK细胞每隔2-3d传代一次，补充细胞因子和新鲜制备的K562细胞。

CD34+造血干细胞

Nature Medicine (2019). doi: 10.1038/s41591 -019-0401 -y

Highly Efficient Therapeutic Gene Editing of Human Hematopoietic Stem Cells.(高效的人造血干细胞基因编辑治疗)

作者：YuxuanWul, Jing Zeng 1, etal.

单位：1.Division of Hematology/Oncology, Boston Children' s Hospital, Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Stem Cell Institute, Broad Institute, Department of Pediatrics, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA

SS：前期研究证明，BCL11A红系增强子的核心序列是抑制成熟红系细胞中HBF所必需的，但在非红系细胞中是必不可少的。CRISPR-Cas9介导的基因修饰在造血干细胞(HSCs)中表现出不同的效率、特异性和持久性。在这里, 我们证明了 Cas9： sgRNA核糖核蛋白介导的+58BCL11A红系增强子GATA1结合位点内的切割导致其的高度破坏, 降低了 BCL11A的表达，并诱导了胎儿y-珠蛋白。我们优化了在患者来源的造血干细胞中进行无选择的靶点编辑的条件，将其作为一种几乎完全的反应，未检测到的遗传毒性或对干细胞功能的有害影响。与微同源介导的末端连接修复相比，造血干细胞优先进行非同源修复。移植编辑的SCD造血干细胞的红系后代表达治疗水平的HbF并抵抗镰刀病，而0-地中海贫血患者的红系后代表现出珠蛋白链的平衡得以恢复。

NK-GFP

筒要试验方底：

从健康供体，镰状细胞病病人和P -地中海贫血病人外周血动员CD34+造血干细胞，用CD34+试剂盒富集 CD34+ 造血干细胞。CD34+ 造血干细胞培养在 X-VIVO 15 (Lonza, 04-418Q)补充 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL TPO和100 ng/mL Flt3-Lo CD34+造血干细胞复苏后24h进行核转染。

Cas9和sgRNA孵育前，在Cas9蛋白里加入30%甘油。转染前Cas9和sgRNA孵育15分钟。

对于20uL体系，50,000个细胞重悬在20uL核转染P3 buffer中，加入RNP(200pmol Cas9和200pmol sgRNA),程序选择 EO-100；

对于100uL体系，5M个细胞重悬在100uL核转染P3 buffer中，加入RNP(1000pmol Cas9和1000pmol sgRNA),程序选择 EO-100；

核转结束后将细胞重悬于含有细胞因子的X-VIVO培养基中，并在24小时后换成EDM以进行体外分化。

小鼠移植实验注射前，将细胞在含有SCF, TPO和Flt3-L的X-VIVO 15中保存0-2天。

结论：文章优化了 sgRNA,在SpCas9蛋白增加额外的NLS,优化了核转染buffer,在健康供体和病人供体的 CD34+造血干细胞中得到了约95%的编辑效率，并且没有检测到基因毒性，可以为长期移植造血干细胞的编辑效率、特异性和持久性方面提供解决方案。

Monocytes单核细胞/DC细胞

Cancer Immunology, Immunotherapy (2020). doi:10.1007/s00262-019-02466-x

Autologous monocyte-derived DC vaccination combined with cisplatin in stage III and IV melanoma patients: a prospective, randomized phase 2 trial.(在III期和IV期黒色素瘤患者中联合钳化合勒进行自体单檳细胞来源的DC疫苗19种：一嗔前曜性随机2期试验。) 作者：Steve Boudewijns 1, et al.

单位：1.Department of Medical Oncology, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

HS:

背景：自体树突状细胞（DC）疫苗可以诱导肿瘤特异性T细胞，但是其作用可以通过免疫抑制机制来抵消。铠化合物已显示出体内免疫调节作用，可增强DC疫苗接种的效力。

方法：这是一项前瞻性、随机、开放的2期研究，包括III期和IV期黑色素瘤患者接受gp100和酪氨酸酶 itiRNA负载的单核细胞来源的树突状细胞联合或不联合顺钳的3次双周疫苗接种。主要目标是研究免疫原性和可行性，而次要目标是评估毒性和存活率。

结果：对22例III期和32例IV期黑色素瘤患者进行分析。在接受钳化合物和不接受铠化合物的DC疫苗接种的患者中，抗原特异性CD8+T细胞分别为44%和67%,功能性T细胞应答分别为28%和19%o 4例患者因毒性停用钻化合物，继续DC单药治疗。DC单一疗法没有发生与治疗相关的3级或4级不良事件。在联合治疗期间，发生了一个与治疗相关的3级不良事件，即由于液体超负荷而导致的失代偿性心力衰竭。临床结果参数没有明确显示有显著差异。

结论：DC疫苗和祐化合物联合治疗黑色素瘤・患者是可行和安全的，但与DC疫苗单独治疗相比，似乎并不能产生更多的肿瘤特异性T细胞应答或改善临床结果。

小结：从白细胞分离产物中富集单核细胞，将单核细胞在X-VIVO 15中进行培养，补充2%人血清，500 U/mL IL-4, 800 U/mLGM-CSF, 10ug/ « mL KLH （血蓝蛋白）。DC 在 10ng/mL TNF- a, 5 ng/mL IL-1 p, 15 ng/mL IL-6 和 10ug/mL 前列腺素E2中分化为成熟的DC。用于DTH皮肤实验的细胞，培养时使用不含KLH的培养基。

X-VIVO 15中加入2%人血清，每2x105个 PBMC,加入 4ug KLH 刺激 PBMC。

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NK自然杀伤细胞

CD34+造血干细胞

Monocytes单核细胞/DC细胞

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