1. 工作背景

探究在芝麻、大豆以及拟南芥中FAD4-like基因家族进化关系，并使其可视化（进化树）

1. 操作环境及软件的准备

虚拟机应用：VMware Workstation pro 17

虚拟机操作系统：Ubuntu

MobaXterm：用于在虚拟机与宿主机之间传输文件

MEGA 11：用于生成基因家族进化树

1. 数据支持

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1. 分析步骤

STEP1: 根据已知protein ID（在本次练习中为拟南芥的At1g62190、At2g22890、At4g27030）在对应的物种数据库（在本次练习中为atha.fasta）中获取对应protein ID的sequence信息，并输出为.fasta格式文件

less -S atha.fasta  #tip在此使用less -S打开atha.fasta文件

出现如下情况，即.fasta文件的文本格式（每个protein ID后接其sequence信息）

#tip在less浏览器中使用 “/ + 文本”的方法对ID对应的信息进行查找
/At1g62190
/At2g22890
/At4g27030

使用vim新建并编辑.fasta，成功查找并复制sequence信息后，将信息导入至新的.fasta文件（在此命名为query.fasta）

vi query.fasta

至此步骤一结束

STEP2: 在此步骤中，我们需要建立芝麻、大豆以及拟南芥的全部蛋白质序列库，并将At1g62190、At2g22890、At4g27030的序列信息比对其中。为减少工作步骤，我们将上述三个物种的蛋白质序列库合为一个总序列库，这样只需要进行一次比对即可进行后续操作。

将三物种蛋白质序列库合为一个总数据库(all.fasta)

cat atha.fasta gmax.fasta sind.fasta >all.fasta

至此步骤二结束

STEP3: blast比对

首先我们要在虚拟机上安装blast包，并查看其使用方法

conda install blast #tip使用conda安装blast包
blastp -help #tip查看blastp（蛋白质比对）使用方法

可知进行blastp比对的命令行用法为

blastp -query <filename1> -db <databasename> -out <filename2> -evalue <evalue> -outfmt <0-18>
#tip filename1是对比文件 databasename是blastdb数据库 filename2是比对结果文件 evalue是e值 0-18对应结果文本输出格式

-db后的参数bingfei之前整合的all.fasta文件，而是blast比对特定的数据库格式，在运行上述代码之前我们应先将all.fasta转化为blast数据库blastdatabase.fasta，方法如下

makeblastdb -help
makeblastdb -dbtype prot -in all.fasta -out blastdatabase.fasta

构建好blastdb数据库后，我们运行blastp比对程序，并命名比对结果为compare.out,代码如下

blastp -query query.fasta -db blastdatabase.fasta -out compare.out -evalue 1e-20 -outfmt 7

获得比对结果，我们将compare.fasta用less -S命令行打开

less -S compare.out

我们在设置e值为1e-20条件下获得了比对结果，但我们要获得其他物种同家族的条件为%identity>50且e值为<1e-30,在我们重新调试参数后，将满足上述条件的文本第二列提取出来，多余的文本删除，完成去重复，并将最终序列存入proteinID.txt文件中，代码如下

grep -v "#" compare.out | awk '$3>50 && $11<1e-30 {print $2}' | sort | uniq > proteinID.txt

至此，我们完成了blast比对并获取了三个物种的FAD4-like降家族基因

STEP4: 根据蛋白质ID获取对应蛋白质序列

此过程我们需要用到seqtk包

conda install seqtk
seqtk #tip了解其使用方法

进行获取,并保存至proteinSequence.fasta

seqtk subseq all.fasta proteinID.txt > proteinSequence.fasta

至此我们完成了基因家族蛋白质序列的获取

STEP5: 将proteinSequence.fasta导入MEGA 11生成进化树

MEGA 11蛋白质序列比对

MEGA 11基因家族进化树

至此一个简单的基因家族分析就完成了！

期待和各位感兴趣的伙伴们交流