漫谈16S的前世今生

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16S的基础概念

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

关键词：普遍、保守、大小适中、可变区！

1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。

2、在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。

3、16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1540 个核苷酸，便于序列分析。

4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16S的结构

16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。

16S拥有9个可变区域，其结构和分布，如下图所示：

图1. 引物与16S可变区的相对位置[8]

图2. 嗜酸乳杆菌16S为例展示引物和可变区位置[8]

基于16S全长的菌种鉴定(一代测序)

工作对象：已培养的纯菌落

所用技术：一代测序仪3730

工作流程：

核酸提取–>基因扩增–>产物纯化化–>测序反应–>序列比对

graph LR
核酸提取-->基因扩增
基因扩增-->产物纯化
产物纯化-->测序反应
测序反应-->序列比对

16S全长常用引物序列：

Name	Sequences
8F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT
sgF	AGAGTTTGATCATGGCTCAG
sgR	TAGGGTTACCTTGTTACGACTT

试剂成本： <100元

优点：可辅助常规菌种鉴定方法，如显微形态和培养特征以及理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等方法，提高菌种鉴定的准确度。

缺点：仅能用于纯菌！仅能用于纯菌！仅能用于纯菌！

基于16S的菌群结构分析(二代测序)

工作对象：临床样本（如粪便、脑脊液、血液、尿液等）、环境样本（土壤、污水等）

所用技术：二代测序仪，如Illumina的Hiseq和Miseq、Thermo的Ion Torrent，以及Roche的454（已停产）

工作流程：

基因组DNA–>样本质控–>PCR扩增建库–>文库质控–>illumina Hiseq2500/Miseq测序–>原始数据–>数据质控–>高质量数据–>生物信息学分析

部分常用引物序列：Table 1. Primer selection table for specific 16S rRNA gene region to be amplified.

试剂成本：~ 100 ~ 400元/样本，由使用耗材等级、人力成本决定。

优点：通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，反映样本中细菌的分类和丰度,获得样本物种分类，物种丰度，种群结构，系统进化，群落比较等诸多信息，可用于临床样本的未知病原菌检测。

缺点：（1）受限于二代测序的读长，目前只能最多测16S九个可变区中的2个，一般为V3-V4区。因此对菌群的分辨率，部分菌种只能分辨到属水平。

（2）缺少SOP实验方案。不同实验因素对实验结果影响较大。详情可参照前贴【好文共赏】宏基因组实验的那些坑-16S扩增子建库方法的各影响因素

（3）相较于WGS宏基因组测序，16S宏基因组也可用于功能学方面研究，但不准确。详情可参照前贴微微，我想测个序啊（宏基因组篇）

16S的未来：三代测序

读长短分辨率低咋办？上三代测序啊！

Pacbio测序技术用于16S宏基因组，已有相关的文献发表

参考文章：High-resolution phylogenetic microbial community profiling 附图2

一次上机测通9个可变区，分辨率高，准确度高，更适用于临床样本中未知病原检测和其他科学研究应用。

可惜，由于未解决样本pooling等原因，其价格居高不下，目前还在八千元一个样本的水平，高昂的费用极大的制约了科研人员使用的积极性。

此外，新近进入中国市场的Nanopore目前尚未由应用于16S的实际案例出现。相较于Pacbio，Nanopore测序技术在灵活度方面更胜一筹，是否能用于16S相关研究，笔者对其报以极大的期待。

Reference

Illumina官方16S建库手册 https://www.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf
CaporasoÂ JG,et al. 2011.Â Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.Â Proc Natl Acad Sci U S A.Â 108 (Suppl):4516â€“4522.Â doi:10.1073/pnas.1000080107.
ParadaÂ AE,Â et al. 2015.Â Every base matters: assessing small subunit rRNA primers for marine microbiomes with mock communities, time series and global field samples.Â Environ Microbiol. doi:10.1111/1462-2920.13023.
ApprillÂ A, et al. 2015.Â Minor revision to V4 region SSU rRNA 806R gene primer greatly increases detection of SAR11 bacterioplankton.Â Aquat Microb EcolÂ 75:129â€“137.Â doi:10.3354/ame01753.
Jiang, H.,Â et al. 2006. Microbial Diversity in Water and Sediment of Lake Chaka, an Athalassohaline Lake in Northwestern China. Applied and Environmental Microbiology. 72 (6): 3832-3845. doi:10.1128/AEM.02869-05.
Walker, A.W.,Â et al. 2015. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome 3:26. doi: 10.1186/s40168-015-0087-4.
Muyzer, G.Â et al. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59:3 695-700.
http://omegabioservices.com/index.php/16s-reference/
https://teachthemicrobiome.weebly.com/sequencing-the-microbiome.html

以上部分资料参考于网络，并感谢宏基因组讨论群各位老师提供相关资源，在此致谢。

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