iCELLis 在病毒载体疫苗上的应用

自新冠疫情爆发以来，全国人民都在时刻关注疫情的发展态势，备受瞩目的是奋斗在第一线的医护人员以及全国的医疗科研人员，他们都一直投入其中在设法改进临床治疗方法，提高治愈率。与此同时，疫苗的研究进展也成为大家重点关注对象，据生物制品圈的不完全统计，全球现有近90家单位开展新冠疫苗的研发项目60余个。国内外在疫苗研发上有多条技术路线在同步开展，包括病毒疫苗（灭活与减毒）、病毒载体疫苗、核酸类疫苗（mRNA疫苗和DNA疫苗）以及重组亚单位疫苗（蛋白质/VLP）。这是一场科学与病毒的赛跑，鉴于目前全球疫情形势严峻，疫苗的快速研发与生产已经成为我们人类最终战胜这次疫情的关键要点之一。

对于在研疫苗重要品种之一的病毒载体疫苗，本文总结了颇尔公司明星产品iCELLis在其生产中的应用数据，以方便疫苗研发工作者及业内同仁参考。

病毒载体疫苗是什么？

病毒载体疫苗是利用基因工程技术将编码病原体保护性抗原的基因导入病毒活载体中使之表达的活疫苗。病毒载体疫苗兼具灭活疫苗的安全性强的优势及活疫苗的免疫效果好、成本低等优点，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，甚至粘膜免疫。病毒载体中可以插入多个不同病原的抗原基因并同时表达，从而实现“一针防多病”的目的，为多价疫苗或多联疫苗的研制提供了新的可能。利用成熟的疫苗载体，可以快速制备针对新发病毒性疫情或流行毒株的疫苗候选，大大减少了新型疫苗的研制周期。

常用病毒载体

病毒载体疫苗完成构建并确认有效后，如何快速有效扩大生产就成为难点，在此方面可以借鉴基因治疗工艺流程（点击跳转），其核心都是病毒载体的扩增、纯化与制剂。常用于腺病毒、腺相关病毒载体的细胞系为HEK293、HEK293T、A549、Vero等，其细胞培养方式为贴壁培养，其细胞系为贴壁培养方式，目前常用于贴壁细胞的培养体系有细胞工厂、T-flask，但随着工艺的放大，其表现出的培养面积小、占地面积大、人员操作多、染菌风险高等缺点，在生产应用上带来了瓶颈，在大规模的生产中造成了不可忽视的弊端。在此，我们推荐使用颇尔公司的iCELLis固定床生物反应器，以下内容介绍一下此产品在上述相关病毒载体制备过程中应用的一些实例。

iCELLis固定床生物反应器

颇尔公司提供的iCELLis生物反应器系统是一种自动化、一次性的固定床生物反应器，其包含两个系列：iCELLis nano与iCELLis 500（见图一），分别能够满足小规模与大规模生产的要求，且符合GMP规范。每种反应器都有三种床层高度、两种压缩比例，图二中列出iCELLis系列与其他培养体系面积之比。iCELLis系列反应器为贴壁细胞提供了良好的细胞生长条件。固定床中填充医药用级PET材质的3D微载体片，为细胞的粘附提供了支撑，其控制器配备灌注功能，并兼具自动控制的搅拌，温度，pH和溶解氧的功能，使得生物反应器能够自动化控制细胞培养、并实时准确地监测生产参数，这是常规的细胞工厂及转瓶所不具备的优势。

iCELLis nano (0.53 m²-4 m²)

iCELLis 500+ (66 m²-500 m²)

图一. iCELLis系列生物反应器

图二. 不同培养体系表面积的比较

应用实例一

Finvector公司[5]使用iCELLis nano系统用于HEK293细胞系AdV5的工艺开发，iCELLis反应器培养AdV5工艺流程图见图三，该公司也开展了在T瓶、iCELLis nano、iCELLis 500三种培养体系下的研究，研究结果如图四所示，在这次研究中，iCELLis系统也被证实是用以支持HEK293细胞系出色的生产系统，该反应器具有表层通气、自动控制系统，可最大程度减少批次间的差异，在这项研究中，也体现了iCELLis 作为一次性系统的优势，其固定床、管道都是无菌且一次性使用，无需清洁及灭菌验证，缩短了前期准备时间。针对于腺病毒载体的放大生产，iCELLis 系列反应器符合GMP标准，在未来工艺放大生产中是非常必要的条件。

图三. iCELLis工艺流程图

图四. iCELLis nano 和iCELLis 500病毒滴度的比较

应用实例二

Rentschler公司[6]研究了传统的2D培养体系与iCELLis 生物反应器的研究，结果表明在两种培养体系下，总的细胞数目及代谢数据（糖、乳酸的浓度，pH）基本保持一致，结果见图五，证明了细胞代谢并未因为反应体系的改变受到影响，同时，在荧光显微镜下观察，两种反应体系的转染效率都很高，见图五。Rentschler的研究也证实了iCELLis nano能够满足低密度细胞接种（1*104cells/cm2）培养的性能，iCELLis nano作为自动化的控制设备为病毒载体的工艺研究提供了更多的可能性。

图五. ICELLis nano与2D平板关于代谢数据与转染效率的比较

应用案例三

诺华公司[7]为了评估iCELLis 500在贴壁HEK293细胞中大规模生产AAV的应用，采用了iCELLis nano用于开发瞬时转染过程，并且依据nano开发的条件应用在放大的333m2的iCELLis 500反应器中，最终收获的总病毒滴度为1*1016Vg，并得出iCELLis nano的工艺可直接线性放大到iCELLis 500中的结论。同时，Xpansion反应器作为ICELLis 500的种子反应器应用其中。St.Jude儿童研究医院[8]应用0.53m2规模的iCELLis nano，在HEK293T/17细胞下优化腺相关病毒载体制备工艺，使其最终滴度可至6.78*1010vp/cm2。

结语

病毒载体的生产过程需要较大的表面积用于贴壁细胞培养。固定床生物反应器是支持大规模生产病毒载体的理想设备。颇尔生命科学公司的iCELLis固定床生物反应器已经在全球范围内用于多种病毒载体和病毒生产

参考文献：

[1] 杨勇, 周东明. 腺病毒载体疫苗的临床研究进展[D]. , 2014.

[2] Nieto K, Salvetti A. AAV vectors vaccines against infectious diseases[J]. Frontiers in immunology, 2014, 5: 5.

[3] 安德烈・尤里耶维奇・叶戈罗夫, 博里斯・费尔科, 阿尔乔姆・亚历山德罗维奇・克罗欣, 等. 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体.

[4] López-Gil Elena,Moreno Sandra,Ortego Javier,Borrego Belén,Lorenzo Gema,Brun Alejandro. MVA Vectored Vaccines Encoding Rift Valley Fever Virus Glycoproteins Protect Mice against Lethal Challenge in the Absence of Neutralizing Antibody Responses.[J]. Vaccines,2020,8(1).

[5] Lesch H P, Heikkilä K M, Lipponen E M, et al. Process development of adenoviral vector production in fixed bed bioreactor: from bench to commercial scale[J]. Human gene therapy, 2015, 26(8): 560-571.

[6] Antje Pegel, Jessica Wegele,etal. Setting up transfection-based recombinant AAV production in the iCELLisTM single use fixed-bed bioreactor.

[7] Kaspar B K, Gardell B, Chung K, et al. Assessment of an Adherent HEK293 Cell Transfection Process for Scalable AAV Production in the iCELLis ® 500 Fixed-Bed Bioreactors[C]//MOLECULAR THERAPY. 50 HAMPSHIRE ST, FLOOR 5,CAMBRIDGE, MA 02139 USA: CELL PRESS, 2019, 27(4): 226-227.

[8] Powers A D, Piras B A, Clark R K, et al. Development and optimization of AAV hFIX particles by transient transfection in an iCELLis® fixed-bed bioreactor[J]. Human gene therapy methods, 2016, 27(3): 112-121.

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