2020.8.28丨转录组、全转录组方案设计和案例解析

知识点梳理
- 方案设计
  - 研究背景
    - 本课题组前期工作的总结，当前研究领域文章综述，研究的目的。
    - 前期工作：
      - 种质资源
      - 生理指标
      - 优良性状
    - 相关研究：
      - 查找文献，与高通量测序相关的文献
      - 搜索：物种拉丁名+transcriptome+？
      - 百度学术 http://xueshu.baidu.com/中文、方便、可以迅速对物种信息、研究背景进行了解
      - NCBI pubmed https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
      - 谷歌学术镜像 https://xueshu.glgoo.org/
      - 全文：
        http://www.sci-hub.ac.cn/http://www.geenmedical.com/
    - 研究目的
      - 明确研究目的，需要的测序手段
  - 实验设计
    - 实验材料
      - 正常表型材料
        
        可研究生长发育过程，高温、干旱等非生物胁迫和病菌、虫害等生物胁迫下的转录组变化
      - 特殊表型材料
        生长发育速度不同、组织器官形态不同等，面对各种胁迫表现出不同程度抗性和敏感性。
      - 不同遗传背景材料
        不同物种、不同品种、不同品系等。
        
        自然群体材料，遗传背景尽量不要差异太大，可用同一套参考基因组进行数据分析。
        
        遗传群体材料，尽量选择稳定遗传的材料，自交后代不会出现形状分离的情况。
        
        杂合度较高的物种，一定选择遗传背景较一致的个体进行转录组测序。
        
        遗传背景差异较大时，可用直系同源基因进行差异分析，如不同物种。
      - 不同地域环境材料
        同一材料在不同地域环境，如同一猕猴桃品种分别在湖南和四川生长。
        
        重点关注表型直接相关的下游基因和通路，如挖掘湖南和四川猕猴桃糖分含量不同的相关基因和代谢途径
        
        不同地域不同季节的转录组数据，构建基因表达调控网络，建立多因素（各环境因子相互作用）作用模型。
    - 处理方式
      - 定义
        
        研究实验材料在各种不同环境因素的影响下的响应机制，可在自然环境条件或者实验是模拟各种处理。
      - 生物胁迫
        影响生物体生长发育的各种生物因素的总称。一般是由于感染或者竞争引起的，比如，细菌、真菌引起的病害，昆虫咬食，杂草以及寄生植物等。
      - 非生物胁迫
        过渡或不足的物理或化学条件影响生物体生长发育，如干旱或洪涝，高温或冷害，盐碱、微量元素（N/Pi/K)、重金属离子、不同光照等。
        
        l实验处理程度：
        不同程度处理（如30℃、40℃），
        
        不同程度干旱处理（如不同浓度PEG处理），
        
        不同Nacl 处理，不同浓度的重金属处理（如镍、镉处理等）。
    - 取样部位
      - 定义：
        
        不同组织或器官（根、叶片等或动物心脏、肝脏、脾等）、不同组织细胞类型（表皮细胞、叶肉细胞）等。
      - 不同组织或器官
        山茶花，五个组织类型：幼嫩叶片、雄蕊、花瓣、心皮和花芽，三个生物学重复进行全转录测序分析
      - 不同细胞类型
        杨树树干冷冻超薄纵向切片，按照横向组织组织结构将切片进行混样。切片主要来自4 个发育组织：韧皮部、形成层、早期木质部和成熟木质部。
    - 取样时间、
      - 取样的时间点
      - 生长发育的不同时间点
        在洋葱球茎开始膨胀后三个时间点取样，每个时间点3个生物学重复，进行全转录组测序。
      - 处理后的不同时间点。
        盛花后双层黄黑色纸袋处理40d，收获前十天去袋处理 0 H , 6 H , 2 4 H , 1 4 4 H 不去袋 6HC,24H,144HC作为对照，每个样品3个生物学重复，进行全转录组测序。
    - 三个生物学重复
    - 发育调控取材思路
      - 同一组织+不同发育时期
        
        研究组织不同发育时期调控机理
      - 不同组织+同一发育时期
        研究组织特异表达性状
      - 不同组织+不同发育时期
        研究组织特异表达性状及不同发育时期的动态变化
    - 环境适应取材思路
      - 不同处理时间
      - 不同处理程度（温度、浓度）
      - 不同取样部位
      - 对照组
    - 免疫互作取材思路
      - 关注宿主、关注病原体、宿主-病原体的联合分析
      - 典型的三因素实验，每个条件设置3个重复。
      - 配合时间点选择的方法有：
        1. qRT-PCR已经研究过或类似物种研究过的，伴随侵染时间不同，表达量有明显差异的基因辅助检测，从而考虑时间点的选择。
        
        2. 显微观察确认病原物侵入情况。
        
        3. 生理生化指标，确认取样时间。
    - 野生/突变型
  - 数据挖掘
    - 如何分组差异比较，重点关注哪些基因/ 通路，后期如何验证。
- 案例解析
  - 转录组研究揭示红皮沙梨套袋对光响应花青素富集的影响
    - 文章思路
      - 测定中国红砂梨果皮去袋后和对照组，果皮表型和主要色素的变化。
      - 转录组测序分析去袋处理和对照组差异表达基因
      - 用共表达网络分析定花青素相关的差异表达基因，得出早、中、晚光响应基因。
      - 对光响应的基因进行注释、转录因子预测激素相关分析，阐述花青素合成和袋装着色处理机制。
  - 时空调控和细胞器转录组协同调控拟南芥叶片衰老的机制（两者联合分析）
    - 文章框架
    - 总结
      - miRNA-mRNA联合分析，深入数据挖掘，解析拟南芥衰老时空调控分子机制；
      - 预测差异miRNA、tasiRNA、21-nt smRNA的靶基因，并进行功能富集分析，分别鉴定叶片发育早期和晚期各种小RNA调控的重要生物学过程。
      - 重点分析三种差异小RNA对TF的调控作用，其中在衰老期小RNA调控的主要是NAC 类转录因子，已有研究显示该家族在叶片衰老中发挥重要调控作用。
  - 系统鉴定白菜花粉发育和授粉受精过程中表达的长链非编码RNA（三者联合分析）
  - 全转录组解析绿甜椒冷胁迫响应机制（四者联合分析）
    - 方案设计
      - 流程图
个人总结
- 协助老师实验设计有助于把订单做大
- 对于植物性状，可以简单了解一下（例如花青素作用）
- 可以通过共表达网络分析鉴定花青素相关的差异表达基因
- 联合分析越多，不一定影响因子越高，主要还是看实验设计

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