易基因|m5C RNA甲基化测序技术---从mRNA到全转录组(mRNA+lncRNA+tRNA)m5C单碱基分辨检测|技术解读
易基因|m5C RNA甲基化测序技术---从mRNA到全转录组(mRNA+lncRNA+tRNA)m5C单碱基分辨检测|技术解读
m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时,可以对翻译进行调节;存在于rRNA上时,可以对核糖体的生物合成进行质控;存在于mRNA上时,则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。RNA甲基化(m5C)与人类疾病密切相关,其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
RNA-BS-seq(RNA-Bisulfite-sequencing)是一种检测m5C的强有力技术。该技术利用重亚硫酸盐处理RNA,使RNA上没有发生修饰的C被转化为U,而发生m5C修饰的C碱基则保持为C。经PCR处理后,U转变成T,这样便将m5C与C区分开来。
易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序(RNA-BS-seq)服务,在经重亚硫酸盐处理RNA后,结合高通量NGS策略,可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。
技术优势:
- 高深度:超高深度重亚硫酸盐处理,检测准确性极高;
- 高通量:结合高通量NGS,全转录组范围内检测;
- 单碱基:单碱基分辨率,快速检测和分析RNA中的m5C。
研究案例
一、斑马鱼:m5C修饰在生理和病理进程中的重要调控作用
2019年8月,在Molecular Cell(17.97)发表的RNA 5-methylcytosine facilitates maternal-to-zygotic transition through preventing maternal mRNA decay文献,研究了5-甲基胞嘧啶(m5C)如何参与调控母源mRNA稳定性维持,发现m5C通过新结合蛋白Ybx1调控母源mRNA的稳定性,进而调控斑马鱼母源-合子转换(maternal-to-zygotic transition, MZT)及早期胚胎发育进程。通过绘制斑马鱼早期胚胎发育过程中RNA m5C甲基化图谱,发现在母源-合子转换过程中,m5C修饰的母源mRNA比未修饰的mRNA更稳定。研究结果揭示:m5C修饰通过其结合蛋白Ybx1招募Pabpc1a维持母源mRNA稳定性从而保证母源-合子转换有序机制的发现,进一步证明其在调控重要生理和病理进程中的重要作用。
二、肿瘤:单碱基分辨率下分析人类膀胱尿路上皮癌(UCB)样本中mRNA的m5C修饰
2019年,发表在Nature Cell Biology(IF: 28.824)上的5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs的文章,通过单碱基分辨,分析人类膀胱尿路上皮癌(UCB)样本中mRNA的5甲基化胞嘧啶(m5C)修饰,鉴定出大量的癌基因mRNA携带高甲基化m5C修饰位点,并且高甲基化修饰基因在UCB样本中呈现高表达。此外证明,YBX1可以特异性的识别m5C位点(Reader),YBX1通过募集ELAVL1蛋白维持靶向mRNA的稳定性。此外发现,NSUN2和YBX1通过结合HDGF基因3’端非编码区域的m5C位点驱动UCB的发病机制。本文揭示了m5C mRNA修饰对癌基因激活调控的新机制,也为不同肿瘤研究提供了新思路和潜在的治疗策略。
三、哺乳动物:m5C修饰在mRNA出核和转录后调控中发挥重要作用
2017年,发表在Cell Research(IF: 25.617) 上,题为5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader的研究发现,m5C修饰在富含CG的区域和翻译起始位点下游的区域富集,在哺乳动物转录组中具有保守的、组织特异性的和动态的特征。此外,mRNA中m5C的形成主要是由RNA甲基转移酶NSUN2催化的,且m5C在体内是由mRNA运输因子ALYREF特异性识别。NSUN2调节ALYREF的核-质穿梭、RNA结合亲和力和相关mRNA的出核。该研究提供了哺乳动物转录组的m5C的全面概况,并表明m5C修饰在mRNAc出核和转录后调控中发挥重要作用。
四、人细胞:重亚硫酸盐处理结合高通量NGS策略,单碱基分辨率检测(h)m5C修饰分布
2021年,发表在RNA Biology(IF: 4.652)上,题为Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs文章,通过重亚硫酸盐处理结合高通量NGS策略,以单核苷酸分辨率系统地分析miRNAs中的(h)m5C,即BS-miRNA-seq,单核苷酸分辨率系统地检测了人类细胞系和人外周血单核细胞(PBMC)中miRNAs上的(h)m5C修饰,并通过开发的专用的分析流程(MAmBA)分析了样本中的(h)m5C甲基化图谱,发现(h)m5C是人miRNAs中广泛存在的修饰,并不局限于CG序列,并且通过m5C和hm5C的抗体免疫沉淀验证了实验结果,也首次表明了人类miRNA包含hm5C修饰。
(详细解读:BS-miRNA-seq技术发现人类microRNA中CpG和非CpG上的(h)m5C修饰)
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参考文献:
Yang Y, et al.RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol Cell. 2019 Sep 19;75(6):1188-1202.e11.
Chen X, et al.5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat Cell Biol. 2019 Aug;21(8):978-990.
Yang X, et al.5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Res. 2017 May;27(5):606-625.
Carissimi C, et al.Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs. RNA Biol. 2021 Dec;18(12):2226-2235.
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