2020.8.28丨转录组、全转录组产品概述和应用方向
- 知识点梳理
- 转录调控是基因表达调控的一种重要方式
- 转录水平调控
- 翻译水平调控
- 翻译后水平调控
- 转录调控测序研究热点
- RNA分类
- 转录组研究
- 概念
- 转录组(transcriptome):
- 特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合,包括 mRNA和ncRNA,从整体水平研究基因功能和基因结构,揭示特定生物学过程的分子机理。
- 转录组测序(RNA-seq):
- 通过第二代高通量测序技术进行cDNA测序,全面快速地获取某一物种特定器官或组织 在某一状态下的几乎所有转录本。
- 一般转录组测序指对mRNA反转录cDNA进行转录组测序分析。
- 可分析转录本的结构和表达,发现未知转录本,识别可变剪切位点和SNA等。
- 适用于生长发育、环境适应、免疫互作、野生突变表型、分子标记开发等。
- 转录组(transcriptome):
- 概念
- miRNA研究
- 定义
- MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24nt的小 RNA,在细胞内具有多种重要的调节作用,参与许多生命过程,如细 胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等。
- 特点
- 表达具有组织特异性和阶段特异性。
- 具有高度保守性,即能在其他物种中找到同源体。
- 具有独有的序列特征,如5’端第一个碱基对U有强烈倾向性。
- 一个miRNA可调控多个基因表达,几个miRNAs也可共同调控某个基 因的表达。
- 作用机制
- (1)翻译抑制
- miRNA与靶mRNA通过6-7个碱基互补结合,可导致miRNA在蛋白质翻 译水平上抑制靶基因表达(哺乳动物中比较普遍)。
- (2)mRNA的降解 (最广泛的功能)
- miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。如果miRNA与靶位点完全互补 (或者几乎完全互补),那么这些miRNA的结合往往会引起靶mRNA 的降解(在植物中比较常见)。
- (3)转录调控
- 表观遗传是指在核酸序列水平上不涉及基因组改变的遗传变化。最近研 究发现表明, miRNA影响基因启动子的CpG岛甲基化作用,在转录水 平直接对靶基因进行调控作用。
- (4)其他机制
- (1)miRNA的前体pri-miRNA可翻译为多肽;
- (2)miRNA可与其他功能蛋白相结合;
- (3)miRNA可直接激活TLR受体蛋白(非改变表达 量);
- (4)miRNA可提高蛋白表达水平;
- (5)miRNA靶向调控线粒体相关基因mRNA;
- (6)miRNA可直接激活基因转录过程;
- (7)miRNA可靶向负调控其他非编码RNA的前体 RNA。
- (1)翻译抑制
- 应用方向
- 适用范围广:大部分miRNA来源于基因间区,适用于有参 考基因组或转录组信息的物种。
- 适用研究方向全面:所有适用于转录组研究的生物学性状, 如发育调控、环境适应、免疫互作。
- 产品类型:根据小RNA的不同特征可分为3类: 动植物miRNA鉴定分析 病毒siRNA分析 动植物siRNA鉴定分析:piRNA,NatRNA,phasiRNA (所有piRNA只能应用于动物生殖组织中,植物不能做)
- 联合分析:可以与任何转录调控产品进行联合分析。
- 转录组+小RNA
- lncRNA+小RNA
- circRNA+小RNA+lncRNA
- 甲基化+mRNA+小RNA
- 定义
- LncRNA研究
- 定义
- 长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,其在转录 沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等均具有重要的功能。
- 特点
- 1、lncRNA的长度在200-100000nt之间,具有mRNA相似的结构,经剪 接,具有ployA尾巴以及启动子结构,分化过程中有动态的表达以及不 同的剪接方式,形成不同的lncRNA;
- 2、lncRNA一般无蛋白编码能力,但是有很多lncRNA能编码一些短肽;
- 3、lncRNA的保守性较低;
- 4、lncRNA的表达具有组织特异性以及时空特性。不同的组织表达 lncRNA的量是不同的,即使是同一组织中,处于不同状态时表达量也 不同;
- 5、lncRNA的定位有区别。不同的lncRNA在细胞内(外)的丰度不同。
- 作用机制
- DNA水平:
- 1、在基因上游启动子区转录,干扰下游基因的表达;
- 2、抑制RNA聚合酶II或介导染色质重构、组蛋白修饰,影 响下游基因的表达;
- RNA水平:
- 3、与基因转录本形成互补双链,影响翻译,剪切, mRNA的稳定性(类似miRNA功能);
- 4、与转录本形成互补双链,在Dicer酶的作用下产生内源 性siRNA;
- 8、作为小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前体分子;
- 9、lncRNA起到miRNA海绵作用,调控靶基因表达;
- 蛋白水平:
- 5、与特定蛋白质结合,调节相应蛋白的活性;
- 6、作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体;
- 7、结合到特定蛋白质上,改变蛋白质的细胞定位。
- 作用机制图
- DNA水平:
- 应用方向
- 适用物种:有参考基因组的真核生物
- 定义
- circRNA研究
- 定义
- 环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,呈封闭环状结构,对核酸酶不敏感,比线性RNA更稳定,不易降解,这使得环状 RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。
- circRNA主要是由外显子环化而成,而有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构(lariat)
- circRNA主要来自编码基因的外显子,也可能来自编码基因的内含子、基因间区、UTR区域或非编码RNA基因位点
- 特点
- circRNA无PolyA的尾巴 常规线性的RNA有一些多聚A的尾巴,而circRNA是闭合的环状RNA,其大 部分均是由外显子构成的,所以并无多聚A的尾巴。
- circRNA的细胞定位、丰度 绝大多数circRNA在细胞浆中富集,其丰度有时甚至比相应的线性mRNA高 10余倍。
- circRNA的稳定性:闭合的环状结构使其不易被核酸酶降解。
- circRNA具有细胞与组织特异性,不同物种间进化保守性很强。
- 极少数circRNA翻译为蛋白。
- circRNA作为内源性竞争RNA (ceRNA)
- 多数具有miRNA应答元件,能与miRNA相互作用,从而调控靶基因的表达 。
- 作用机制
- 这张图说的是circRNA的已知功能,可以有多种研究方向,这些都可以作为很好的科研故事,有的在 胞核内,有的来自于胞质中的机制,有的作为分泌物标记marker。
- 细胞核:
- 1.假设转录本的表达量是一定的,circRNA的形成本身影响了其他同源转录本的结果;
- 2.circRNA会滞留在细胞核内,结合核小核糖核酸蛋白,调控某些基因的转录;
- 3.circRNA滞留在核内一定数量后,直接阻断母本DNA的其他转录本的转录,也可以 称之为“负反馈回路调控”。
- 细胞质:
- 4.circRNA机制作为海绵吸附miRNA,正向调控下游靶基因的表达水平;
- 5.circRNA在胞质内吸附蛋白质形成circRNPs行使功能;
- 6.胞质中的circRNA参与翻译成多肽;
- 7.circRNA行使假基因的功能,具有调控基因表达的潜能。
- 细胞外:
- 8.分泌到血液、唾液等体液中作为疾病预测的biomarker,另外它在某些细胞分泌的 外泌体中大量存在,起到了细胞与细胞之间的频繁对话,也是一个研究非常火热的 领域。
- 测序策略
- 两种建库方式
- 定义
- ceRNA
- 2011年,Pandolfi等人提出了一种关于mRNAs、 Pseudogenes,lncRNAs如何相互“交流”的新假说---- ceRNA(competing endogenous RNA,竞争性内源 RNA)的假说,一种RNA间相互作用的新机制,是指所 有类型的RNA都可以通过microRNA应答元件(MREs, microRNA response elements)进行相互作用认为通过 这种ceRNA能形成一种大规模转录调控网络,可以扩大 人类基因组中的功能性遗传信息。
- 团结在以miRNA为核心的RNA调控网络周围
- 全转录组研究
- 定义
- 全转录组是指细胞所能转录出来的所有类 型RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)。
- 目前针对非编码RNA的研究主要集中在 small RNA,lncRNA和circRNA。对特定 细胞的特定状态下全转录组的研究,可以 从RNA层面系统地揭示生物学背后的转录 调控规律。
- 研究意义
- 转录组学是分子生物学研究的重要组成部分,随着科研的深入,获取特定组织或细胞在特定状态下所有转录本 (mRNA和非编RNA)信息的总和,已成为科研工作者最新的迫切需求:与单一的mRNA或ncRNA研究相比,全转 录组主要存在以下优势。
- 单一组学技术不能全景地揭示生命活动的本质规律;
- 全转录组为较新的概念和产品,在转录组基础上加入了非编码RNA的研究 内容,本身是一定的热点研究,有助于提高文章发表档次,且全转录组的 研究对实验材料的限制更少。
- 全转录组测序技术不仅可同时检测mRNA、lncRNA、circRNA、 microRNA,而且可结合多种RNA信息进行ceRNA整合分析,探究其潜 在的调控网络机制,已成为解释生物学现象的研究利器。
- 可以进行两两间关联分析和两者以上ceRNA网络调控分析,有助于缩小 筛选范围,挖掘关键基因。
- 一方面节省了样本量,另一方面使用同一批次样本提高了研究结果可比性。
- 项目性价比高,不需要太多分子实验;
- 适用范围
- 物种
- 有参考基因组物种;
- 普通二代转录组研究较多,基因功能较清楚。
- 研究非编码RNA与基因的转录调控关系。
- 项目
- 经费相对充足;
- 有二代转录组研究基础或一定了解;
- 关注调控类非编码RNA(miRNA、lncRNA、circRNA)及其与功能 基因的调控关系;
- 希望发表高分(5分以上)文章;
- 高性价比,mRNA-miRNA-lncRNA-circRNA,可两两联合发表2篇以上文章。
- 物种
- 研究策略
- 适用情况
- 生长发育
- 环境使用
- 免疫互作
- 突变表型
- 建库测序
- 1+2 = 4
- 联合分析
- 联合策略
circRNA好像写错了
- 联合策略
- 适用情况
- 定义
- 转录调控是基因表达调控的一种重要方式
- 个人总结
- 转录调控六大产品
- 甲基化
- miRNA
- 转录组测序(二代)
- 全长转录组(三代)
- lncRNA测序(全转录组)
- circRNA测序(全转录组)
- 转录组默认为mRNA测序
- lncRNA测序内部包含mRNA建库数据
- miRNA最广泛的功能为:靶向负调控基因的mRNA水 平,介导其降解。
- ceRNA不是RNA,是一种作用机制。
- 全转录组 = 4种产品(mRNA+miRNA+lncRNA+circRNA)
- 转录调控六大产品
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