“单细胞”前瞻 |新型微滴反应筛选技术ATAC-seq数据分析新篇章

来源：www.im.cas.cn/xwzx2018/kyjz/201910/t20191009_5405438.html
http://life.tsinghua.edu.cn/publish/smkx/11191/2019/20191009170114780764738/20191009170114780764738_.html

新型微滴反应筛选技术

中科院微生物所微生物资源前期开发国家重点实验室杜文斌研究组和黄力研究组共同开发了一种新型的微流控界面纳升注射技术（Interfacial Nanoinjection, INJ），该技术可以将传统的生化反应体系微缩在一个纳升体积的油包水微液滴体系中完成。

界面纳升注射(INJ)系统

在性能方面，INJ系统通过高精密度的微体积控制实现不同试剂组分的纳升体积分步添加，兼容96和384孔板，可以在预先填装矿物油的孔板上，按照程序设定加入纳升样品或试剂液滴，用于实现高通量筛选。利用低成本探针可以精确加注的最小体积达到1 nL，当加样体积为5 nL时，体积标准偏差小于11 %。加注的液滴通过离心可以沉降到孔板底部并融合，液滴的融合效率最高，达到99%以上。利用多次加注样品、试剂的方法，可以实现多步反应和浓度梯度配置。系统加注的体积精确性、线性和重现性良好。

FACS-INJ单细胞分析流程和应用

流式细胞荧光激活细胞分选（FACS）是目前最高效的单细胞分选技术，可实现病毒、细菌、真菌和动物细胞的多参数检测和分选；利用荧光标记，可对不同类型的细胞进行有效的区分，分选成功率高。研究团队将INJ与FACS平台相结合，建立了FACS-INJ单细胞分选分析流程，应用覆盖了单细胞表型分析、基因型分析、基因表达分析以及全基因组扩增测序。
　　研究团队首先利用FACS-INJ系统实现了病原菌微生物单细胞耐药基因的PCR筛查和单细胞药敏表型筛查。对于大幅降低临床病原检测的成本，实现脑脊液、房水等难获取微量样品的耐药基因和表型筛查具有重要意义。
　　其次，FACS-INJ系统还可用于动物细胞的单细胞基因表达分析。以小鼠巨噬细胞RAW264.7在细菌胞外多糖处理前后的炎症反应为例，通过荧光激活流单细胞式分选处理前后的小鼠巨噬细胞，基于一步法反转录实时荧光PCR扩增，在单细胞水平解析了次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶（HPRT）基因（看家基因）和白介素1β（IL-1β）基因（炎症反应）表达水平的变化。
　　最后，团队与北京大学黄岩谊课题组合作，建立了基于FACS-INJ的微生物全基因组扩增测序流程，以获得未培养微生物的全基因组信息。该方法获得的微生物基因组污染度较传统的MDA扩增方法显著降低（<5%），显著提高了微生物单细胞基因组数据质量。平台也适用于肿瘤、胚胎等动物细胞的全基因组扩增测序，对肿瘤细胞的单细胞测序的覆盖度达到60-80%**。

ATAC-seq数据分析新篇章

2019年10月8日，清华大学生命学院的张强锋课题组在***《自然通讯》（Nature Communications）上发表题为SCALE方法基于隐特征提取进行单细胞ATAC-seq数据分析（SCALE method for single-cell ATAC-seq analysis via latent feature extraction）的学术文章。
　　真核生物的染色质具有复杂的高级结构，由DNA一圈一圈缠绕在组蛋白上形成串珠式模型并进一步折叠聚集而成。基因的转录必须要将相应的染色质打开形成开放区域才能结合其他的转录调控因子。因此可以说染色质开发区域是基因组编码生命的窗口。单细胞ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）技术在单细胞层次上通过Tn5 DNA转座酶在开放染色质插入测序接头进行标记并测序，从而获取“高分辨“的单细胞精度的染色质开放图谱，并依此揭示细胞异质性的调控机制。
　　越来越多的研究者们应用单细胞ATAC-seq技术，在肿瘤、免疫、发育领域获取大量的测序数据。然而，目前没有一个有效的方法可以很好的分析挖掘海量的单细胞ATAC-seq数据中宝贵的生物信息。单细胞ATAC-seq数据分析的难点在于数据本身。第一，细胞整体的染色质开放位点数有几十万之多，造成所谓的“维度灾难”。另外，由于生物的原因许多潜在的开放没有信号，数据异常稀疏，技术限制带来的数据丢失极大程度上加剧了这种现象。特别的，在二倍体基因组上一个开放区域一般至多只有两个拷贝，使得数据近乎二值化。这些问题都给单细胞ATAC-seq数据的分析带来了巨大挑战。
　　近日，张强锋课题组发表的文章提出了SCALE，利用人工智能深度学习的方法*，结合变分自编码器和高斯混合模型，提取单细胞ATAC-seq数据的隐层特征，将问题从复杂稀疏的高维度的染色质开放图谱空间投射到了简单抽象的低纬度特征空间。这种处理不但可以发现和解析细胞特异性的染色质图谱模式，还通过相似细胞信息共享，填补了技术限制导致的缺失值，从而巧妙地解决了单细胞ATAC-seq数据中高维度、稀疏性、二值化等问题。SCALE提供了完整的可视化、聚类、数据增强、帮助下游生物信息的挖掘，为研究者们解码单细胞表观遗传学提供了有力的工具。

SCALE的模型框架

文章

Yun, J.L.#; Zheng, X.W.#; Xu. P.#; Zheng, X.; Xu, J.Y.; Cao, C.; Fu, Y.S.; Xu, B.X.; Dai, X.; Wang, Y.; Liu, H.T.; Yi, Q.L.; Zhu, Y.X.; Wang, J.; Wang, L.; Dong, Z.Y.; Huang, L.; Huang, Y.Y.; Du, W.B.* Interfacial Nanoinjection-based Nanoliter Single-cell Analysis, Small, 2019, doi:10.1002/smll.201903739. 　　https://www.nature.com/articles/s41467-019-12630-7

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