A systems-biology model of the tumor necrosis factor (TNF) interactions with TNF receptor 1 and 2

摘要

注意:聚集使肿瘤坏死因子受体能够刺激细胞内信号传导。模拟了可溶性配体诱导的肿瘤坏死因子受体1和肿瘤坏死因子受体2的聚集行为。
方法:一个结构化的、基于规则的模型实现了配体无关的配体前结合装配域(PLAD)介导的未连接和连接的肿瘤坏死因子受体的同型低亲和力相互作用。
**结果:**可溶性肿瘤坏死因子启动肿瘤坏死因子受体1信号，但不启动肿瘤坏死因子受体2信号，尽管受体结合，除非它被二次寡聚化。我们考虑了肿瘤坏死因子与信号不全的预组装二聚肿瘤坏死因子受体1和肿瘤坏死因子受体2分子的高亲和力结合，以及连接的二聚体与信号不全的配体-受体簇的二次聚集。已公布的受体数量、亲和力和集群受体的不同测量活性验证了大范围受体和配体浓度的模型模拟。不同的PLAD-PLAD亲和力和不同的受体簇活性解释了可溶性肿瘤坏死因子的肿瘤坏死因子受体刺激活性的观察差异。
可用性:所有的脚本和数据都是在线生物信息学的手稿和补充。
联系方式:dandekar @ biocentre . uni-乌尔茨堡. de
补充信息:补充数据可在生物信息学在线获得。

1导言
肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族(TNFSF)的细胞因子触发许多炎症反应，包括风湿性和自身免疫性反应以及癌症、感染和炎症反应(Sedger和McDermott，2014)。因此，研究和模拟这些配体与其受体的相互作用具有很高的治疗和医学价值。肿瘤坏死因子配体主要表达为非共价连接的同三聚体跨膜蛋白，但在蛋白水解过程中也以可溶性三聚体分子的形式出现(洛克斯利等人，2001)。肿瘤坏死因子受体配体激活一组结构相关的跨膜受体，即肿瘤坏死因子受体超家族成员。因此，给出TNF的名称与都属于TNFRSF的TNF受体1（TNFR1）或TNFR2相互作用。 TNFRSF受体分子结合到TNFSF配体三聚体的启动子之间形成的凹槽中（Wajant，2015）。
例如，肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子受体2复合物的结构表明，单个肿瘤坏死因子同源三聚体结合三个肿瘤坏死因子受体2分子(穆凯等人，2010年)，肿瘤坏死因子受体1与肿瘤坏死因子相关的肿瘤坏死因子受体配体LT的复合物显示出类似的结构(班纳等人，1993年)。这导致了配体介导的TNFRSF受体激活的三聚模型。然而，越来越多的证据表明，肿瘤坏死因子受体配体-肿瘤坏死因子受体复合物组装成更大的簇对于刺激有效的下游信号传导是必要的(图1)。特别是，已经表明肿瘤坏死因子相关因子配体和肿瘤坏死因子相关因子受体的寡聚化状态会影响这种聚集过程(Wajant，2015)(图1)。肿瘤坏死因子受体1和肿瘤坏死因子受体2都被膜肿瘤坏死因子有效激活，但对可溶性肿瘤坏死因子的反应不同。可溶性肿瘤坏死因子也能有效激活肿瘤坏死因子受体1。然而，可溶性肿瘤坏死因子三聚体尽管具有高亲和力结合，却不能激活肿瘤坏死因子受体2(Grell等人，1995)。相反，物理连接的可溶性肿瘤坏死因子三聚体结合并有效激活肿瘤坏死因子受体2信号(施耐德等人，1998；Rauert等人，2010年)。此外，已经观察到可溶性肿瘤坏死因子的细胞附着融合蛋白聚集并激活肿瘤坏死因子受体2 (Gerspach等人，2006)。用由TNFR1或TNFR2的外域和CD95的胞内域组成的嵌合受体进行的交联实验表明，TNFR1聚集和响应可溶性肿瘤坏死因子的更高能力与两种肿瘤坏死因子受体细胞质部分的差异无关(Boschert等人，2010年)。

图1配体结合后TNFR1预组装和簇形成示意图。膜状TNFR1和TNFR2单体能够通过它们的PLAD结构域以低(TNFR1)或非常低(TNFR2)亲和力自聚集。肿瘤坏死因子与预先组装的肿瘤坏死因子受体1单体、二聚体和三聚体高度亲和地相互作用。它同样与TNFR2二聚体和三聚体具有高亲和力，但与TNFR2单体的相互作用效率较低。请注意，即使膜肿瘤坏死因子的低表达也会导致细胞间接触区的高局部浓度(M范围)，而可溶性肿瘤坏死因子的浓度在pM/nM范围内。该图未显示详细的化学反应(参见这些材料和方法)。

鉴于结构和化学证据表明两个cIAP1（或cIAP2）分子的反式激活对于TNFRSF的TRAF2相互作用受体的经典NF B信号传导至关重要，因此需要两个或更多个三聚体配体的TNFR复合物进行二次聚集以激活受体。，例如TNFR2。 TRAF2和TRAF1-TRAF2复合物的晶体结构表明，这些TRAF蛋白形成同三聚体和异三聚体蛋白，因此每个TRAF启动子都具有一个与TNFR2细胞内结构域中包含的短肽基序结合的位点（Park等，1999;郑等人，2010； Mace等人，2010）。因此，三聚体TRAF2蛋白可能与TNF配体TNFR2三聚体的三个胞质尾巴相互作用。现在，已发现由TRAF2（或TRAF1和TRAF2）组成的三聚体以其自动抑制的“封闭”构型募集单个cIAP1 E3连接酶分子。然而，通过两个cIAP1分子的反式激活可以诱导cIAP1的E3连接酶活性。因此，假设两个（或多个）与TNF结合的TNFR2三聚体的二次聚集导致TRAF三聚体介导的两个（或多个）cIAP1 / 2连接酶分子的募集及其随后的促进经典NF B信号传导的反式激活似乎是非常合理的。

肿瘤坏死因子受体的独特特征是一个富含半胱氨酸的结构域(CRD)，它包含在各种肿瘤坏死因子受体类型的胞外结构域的1-6个拷贝中(洛克斯利等人，2001)。对于几种肿瘤坏死因子受体，包括肿瘤坏死因子受体1、肿瘤坏死因子受体2、CD40、CD95和肿瘤坏死因子受体1-4，已经表明膜远端CRD是一个同源蛋白-蛋白相互作用结构域的一部分，称为配体前结合装配结构域(PLAD) (Chan等人，2000；Siegel等人，2000年)。PLAD-PLAD相互作用介导无配体肿瘤坏死因子受体的同聚寡聚化，但在某些情况下也允许形成特定的肿瘤坏死因子受体异聚体，例如在不同类型的肿瘤坏死因子受体之间(Clancy等人，2005)。含有重组可溶性肿瘤坏死因子受体1-或肿瘤坏死因子受体2-的PLAD蛋白可抑制肿瘤坏死因子诱导的受体激活(邓等，2005)。因此，也被认为是一个潜在的治疗目标(邓等人，2005年)。PLADmediated受体寡聚化的化学计量仍然是一个讨论的问题，对PLAD-PLAD相互作用的亲和力和动力学了解较少。

利用基于规则的建模(Fricke等人，2014年)或质量作用动力学和常微分方程(Winkel等人，2012年)对TNFR1活化进行建模的早期工作已经描述了受体寡聚化的关键作用。然而，这些模型没有涵盖和解释单个和相连的可溶性配体三聚体的不同TNFR激活能力。最近的两项建模研究使用动力学蒙特卡罗模拟在分子水平上模拟肿瘤坏死因子及其受体在空间随时间的结合。肿瘤坏死因子受体通过受体-受体的横向相互作用在质膜中形成六角形低聚物(苏和吴，2020a苏、吴，2020b)。然而，这些模型没有涵盖和解释可溶性配体三聚体对TNFR1和TNFR2的不同活化能力，也没有给出聚类过程步骤的具体见解。

我们在这里模拟(1)在没有配体的情况下TNFR1和TNFR2的二聚化，(2)可溶性TNF与二聚TNFR1/2分子的结合，以及(3)这些信号不全的TNF-TNFR1/2复合物与信号活性配体-受体簇的二次聚集。我们进一步考虑了新的实验数据，表明聚集的TNFR1分子比聚集的TNFR2分子具有更高的内在刺激信号的能力。模拟结果表明，肿瘤坏死因子受体1和肿瘤坏死因子受体2自聚集的不同结合亲和力已经足以在响应可溶性肿瘤坏死因子三聚体的活性和非活性受体状态之间构成相当大的不同转变，并且这种差异因肿瘤坏死因子受体1的优异内在受体信号能力而进一步增加，导致观察到的肿瘤坏死因子受体1和肿瘤坏死因子受体2响应可溶性肿瘤坏死因子的不同能力。

2 方法
**单体和三聚体可溶性TNF受体。**为生成TNFR1ed-Flag-GpL和TNFR2ed-Flag-GpL的表达构建体，分别将编码TNFR1和TNFR2胞外域的ed片段与它们的C端遗传融合到编码Flag标签的DNA片段上。和高斯普林斯荧光素酶（GpL）的人性化的无领导者版本（Tannous等，2005）。然后将完整的融合蛋白编码片段插入表达载体pCR3（Invitrogen）。 TNFR1ed-TNC-Flag-GpL和TNFR2ed-TNC-Flag-GpL的表达构建体是通过将编码TNFR1和TNFR2胞外域的DNA融合到一个编码三聚体结构域的DNA片段而产生的（Kammerer等，1998）。鸡腱生蛋白C（TNC;氨基酸110-139，交流编号M23121），其后带有Flag标签和人源化GpL融合蛋白，使用PEI转染在HEK293细胞中瞬时产生，如CD95L-GpL融合蛋白其他地方所述（Lang等等人，2017）。与膜TNF表达细胞的结合研究。将表达细胞膜TNF的CHO细胞和稳定的CHO转染子接种到24孔板中，第二天在37°C与指定浓度的各种TNFR1 / 2-ed配对孵育2小时。 -GpL融合蛋白。用冰冷的PBS洗涤细胞5-10次后，用橡皮警察将细胞刮入50 µl RPMI 1640培养基中，最后用高斯普林斯荧光素酶测定试剂盒（新英格兰生物实验室）测量细胞相关的GpL活性。将特异性结合值计算为总结合值（CHO-memTNF）和非特异性结合值（CHO）之差。通过使用GraphPad Prism 5软件对所有数据集共享相同数量的结合位点的限制，通过非线性回归分析了特定的结合值。

**抑制肿瘤坏死因子诱导的细胞死亡。**将L929细胞接种在96孔板中含有10 %流式细胞仪的RPMI 1640培养基中(每孔10×103个细胞)。第二天，细胞在2.5克/毫升环己酰亚胺的存在下，以肿瘤坏死因子浓度在0.01至100纳克/毫升范围内的三倍进行攻击。其中所述的肿瘤坏死因子样品已经用1克/毫升的各种肿瘤坏死因子受体1型和肿瘤坏死因子受体2型变体预孵育30分钟，以评估这些拮抗剂的抑制作用。活力值通过未处理细胞(100 %活力)和用含有0.01 %叠氮化物、50克/毫升CHX和100毫克/毫升肿瘤坏死因子、TRAIL和Fc-CD95L的细胞毒性混合物(0 %活力)处理的细胞来标准化。

**TNFR1-和TNFR2-介导的IL8产生的上调。**将HeLa细胞和HeLa-TNFR2-TNFR1KO细胞接种在96孔板中，第二天用三聚体TNFR1- (TNF(32W/86T))和TNFR2特异性(TNF(143N/145R)可溶性TNF突变体(Loetscher等人，1993)和TNC-scTNF(143N/145R)刺激，TNF是(TNF(143N/145R)的高活性三聚体变体，因此为了最小化基础IL8产生的背景，肿瘤坏死因子刺激是在完全交换培养基的情况下进行的。第二天，根据供应商的建议，使用酶联免疫试剂盒(美国圣地亚哥生物科学公司)对上清液中的IL8含量进行定量。

**GpL-TNC-scTNF诱导肿瘤坏死因子受体结合和IL8。**将HeLa细胞和HeLa-TNFR2-TNFR1KO细胞接种在96孔板中，第二天用三聚体TNFR1-（TNF（32W / 86T））和TNFR2特异性（TNF（143N / 145R）可溶性TNF突变体（Loetscher）刺激（1993）和TNC-scTNF（143N / 145R）是一种高活性的（TNF（143N / 145R）的三聚体变体，因此包含9个TNF原型（Rauert等人，2010）。在生产中，通过完全交换培养基进行TNF刺激，第二天，根据供应商的建议，使用ELISA试剂盒（BD Biosciences，圣地亚哥，美国）对上清液的IL8含量进行定量。

***GpL-TNC-scTNF对TNF受体的结合和IL8的诱导。***将TNC-scTNF（143N / 145R）的TNF野生型对应物遗传融合到GpL的C末端。所得的GpL-TNC-scTNF在HEK293细胞中瞬时表达，含有该蛋白的上清液用于研究受体结合和IL8诱导。将HeLa细胞和HeLa-TNFR2-TNFR1KO细胞接种在12孔板中（500.000个细胞/孔）。第二天，将每种细胞类型的一半孔的培养基替换为补充有20 µg / ml TNF的新鲜培养基（RPMI 1640，10％FCS），而另一种培养基仅替换为培养基。然后用浓度增加至10 ng / ml（HeLa）和100 ng / ml的GpL-TNC-scTNF（HeLa-TNFR2-TNFR1KO细胞）刺激TNF补充和未补充的细胞。 8小时后，除去上清液，并将细胞在冰冷的PBS中洗涤5次。用橡胶警察将细胞刮入50 µl RPMI 1640培养基中，最后用高斯普林斯荧光素酶测定试剂盒（新英格兰生物实验室）测量源自GpL-TNC-scTNF的细胞相关GpL活性。计算总结合（未补充的细胞样品）和非特异性结合（补充TNF的细胞）之差。使用GraphPad Prism 5软件通过非线性回归分析特异性结合值，以确定Bmax和GpL-TNC-scTNF对TNFR1和TNFR2的亲和力。此外，使用来自BD Bioscience（美国圣地亚哥）的IL8 ELISA试剂盒，将未补充TNF的细胞上清液用于确定GpL-TNCscTNF80诱导的IL8产生。最后将IL8产生相对于相应的特异性结合值作图。

Rulebender中的模型实现
基于规则的建模。 我们建立了受体特异性相互作用模型来模拟受体组织和细胞膜上的配体结合。我们使用RuleBender（Smith等人2012）编辑和可视化以BioNetGen（BNG）语言编写的模型（Faeder等人2009），并评估仿真结果。该模型是基于规则的，并且仿真可以作为ODE系统执行，也可以随机执行，本文提供的结果与ODE仿真相对应。
分子
表1总结了模型中每个分子使用的符号和初始浓度。

常量定义
在表2中，我们给出了所使用的亲和常数的定义以及分配给它们的值。
表2 .常数、定义和参数

方程系统建模
下面给出了模拟反应的摘要。由于这两种受体类型的反应都是相同的，但假设受体类型具有特定的亲和力常数，因此我们在这里介绍TNFR2模型。

TNF配体一次募集一种受体单体，直至形成复合体

2.形成受体二聚体，其随后结合至TNF三聚体。并将受体单体募集到剩余的游离物中TNF-TNFR22复合物中的结合位点。

3.受体形成三聚体，随后与TNF配体结合

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