ctab法提取dna流程图_CTAB法提取DNA
CTAB
法提取步骤：
(1)
在
7mL
离心管中加入
65
℃预热的抽提液
2.5mL
。
(2)
加入
1g
样品液氮研磨，加入巯基乙醇
50μL
，上下震荡，使蛋白质变性沉淀，
65
℃水浴
1h
，每隔
10min
颠倒混匀一次。
(3)
加入等体积
(约
3mL
)
的氯仿
/
异戊醇
(24/1)
混匀，
除去蛋白质，
4
℃平衡离心，
10000rpm
，
10min
。
(4)
取上清(约
2.5mL
)到
7mL
管，加
1/5
体积(约
0.5mL
)
65
℃预热的
CTAB/NaCl
混匀，
加入
2mL
的氯仿
/
异戊醇
(24/1)
混匀，
4
℃平衡离心，
10000rpm
，
10min
。
(5)
取上清，
加等体积
(约
3mL
)
的
CTAB
沉淀液，
颠倒混匀。
65
℃水浴
30min
至沉淀可见。
4
℃平衡离心，
10000 rpm
，
10min
后小心去上清。
(6)
沉淀用
TE
(
0.5mL
)溶解，加入等体积(约
0.5mL
)的酚
/
氯仿
/
异戊醇
(25:24:1)
抽提，
4
℃
平衡离心，
10000rpm
，
10min
。
(7)
取上清加入
2
倍体积的无水乙醇
(
1mL
)
，
再加入
1/10
体积的
NaAC
(
pH 5.2
)
约
0.1mL
。
(8)
-20
℃冰箱
1h
，
4
℃平衡离心，
12000rpm
，
10min
，弃上清，用
70%
酒精清洗
2
次，滤纸
吸去多余水分，超净台吹干。
(9) 0.05mL TE
溶解，
-20
℃保存。
CTAB
法原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,
十六烷基三甲基溴化铵
)
，
是一种阳离子去污剂
,
具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中
(>0.7mol/L
NaCl)
，
CTAB
与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除
蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB
提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)
提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA
螯合
Mg2+
或
Mn2+
离子，抑制
DNase
活性；
NaCl
提供一个高盐环境，
使
DNP
充分溶解，
在于液相中；
CTAB
溶解
细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β
-
巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
PVP(
聚乙烯吡咯烷酮
)
是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，
减少
DNA
中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞
DNA
时，有什么作用？
使蛋白质变性，
同时抑制了
DNase
的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时
,
由于蛋白与
DNA
联结
键已断
,
蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而
DNA
溶
于水相。
使用酚的优点：
1.
有效变性蛋白质；
2
抑制了
DNase
的降解作用。缺点：
1.
能溶解
10-15%
的
水，从而溶解一部分
poly(A)RNA
。
2.
不能完全抑制
RNase
的活性。
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