CTAB法提取植物DNA.ppt

实验原理 1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。 3、进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白：用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构： ①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。 ②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。 ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 1、Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相；4、?CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 5、β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。? ?? 3、DNA的浓度测定和纯度分析 (1)定磷法：是对样品中核酸(DNA和RNA)含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸(硫酸或高氯酸)消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。 (2)紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA，40ug/mL的RNA。 蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。 纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。 操作方法： 将CTAB分离缓冲液置于60水浴中预热； 称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研碎； 取0.1g粉末直接加入1.5ml的EP管中，加人500ul预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀； 样品于65℃保温30分钟； 加等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提(颠倒混匀10次以上)； 室温下12000rpm离心10分钟； 小心取上清置于一个新的EP管中(尽量避免吸取中间层),加入2倍体积的无水乙醇(或2/3体积的异丙醇),轻轻混匀，-20 ℃10min,使核酸沉淀下来； 14000rpm离心10分钟,小心倒去上清液; 1ml 70%乙醇洗涤沉淀2次；在室温下使DNA沉淀干燥； 将DNA沉淀溶于2ul ddH2O,-20℃保存备用。 取5DNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。 2、氯仿的作用？ 氯仿：加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中) 3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡 (异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定) 4、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 N