解读文献里的那些图——流式细胞术
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球、细菌、小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术,被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面,涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域,在各学科中发挥着重要的作用。
如上图所示:细胞悬液在通过流式细胞仪时,一次仅可通过一个细胞,那么机器是怎么分辨不同细胞的呢?这也是我们理解流式细胞图的关键。
在此之前,我们先来了解一个概念:流式通道。
流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道:散射光通道有两个,包括FSC通道和SSC通道,而不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大,有的甚至没有荧光通道。
1.散射光通道
FSC,即前向角散射,它的值代表细胞的大小。细胞体积越大,其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小,利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC,即侧向角散射,它的值代表细胞的颗粒度(与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比)。细胞越不规则,细胞表面的突起越多,细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多,其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度,利用SSC值对细胞进行分群和分类。
当细胞通过激光束时,检测器会检测到细胞或颗粒的散射光,放置在前面的检测器检测FSC,而放置在侧面的多个检测器检测SSC。这样我们得到的就是细胞的物理特征,根据其物理特征进行分群分类。
2.荧光通道
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征,而是其化学特征。如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子,就将这一CD分子的抗体与特定的荧光素偶联,这种荧光素通过荧光通道时会被激发而产生荧光。这样该抗体与被检细胞结合后,就可以被识别到,我们也就能得到就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子(即区分阳性细胞和阴性细胞),以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。
荧光通道接收到的信号越强,表示细胞上结合的荧光素越多,那么细胞表面表达的该CD分子就越多,因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD分子的相对数量。总之,荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱,从而反映细胞上结合的荧光素的量,进一步反映细胞上表达该CD分子的量,最后间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征。
了解了这个概念后,我们就可以很容易的看懂流式细胞图在表达什么。
流式图最常用的是流式直方图和流式散点图,还有一种流式等高线图。流式直方图只能显示一个通道的信息,流式散点图和流式等高线图可以同时显示2个通道的信息。
1.流式直方图
流式直方图是在统计学直方图的基础上进一步发展而成的。我们可以简单的理解为曲线上该点对应的y轴值就是x轴代表的通道的荧光信号值对应的细胞数。
图(1)中100~101(M1)为阴性细胞,101以上的(M2)为阳性细胞;图(2)中2N代表G0/G1期细胞,4N代表G2/M期细胞,两者中间代表S期细胞。
值得注意的是,不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍,而荧光信号强弱之间一般相差很大,阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相差几十倍、几百倍,甚至几千倍,呈指数关系。所以,流式图数轴上FSC值和SSC值以“一般数序形式”表示,而荧光通道值常以“对数形式”(logarithmic scale)表示,在识图时需要注意数轴的表示形式。当然,并不是所有的荧光通道值都以“对数形式”表示,当荧光信号值相差不多时,也可以“一般数序形式”表示。
2.流式散点图
流式散点图能够同时表示两个通道的信息,更加直观和常用,x轴表示一个通道的值,y轴表示另一个通道的值,图中每一点代表一个细胞,该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值,所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值。
如图表示的是某正常人外周血白细胞FSC-SSC散点图。FSC代表细胞的大小,SSC代表细胞的颗粒度,从图中可以看出,根据细胞的大小和颗粒度,正常人外周血白细胞可以分为3群。小细胞、小颗粒度的红色细胞群是淋巴细胞群,T细胞、B细胞和NK细胞都位于此淋巴细胞群;中细胞、中颗粒度的绿色细胞群是单核细胞群;大细胞、大颗粒度的黄色细胞群是中性粒细胞群。
一般在流式分析过程中,先利用FSC-SSC物理图根据细胞的大小和颗粒度将细胞进行分群,然后根据目标细胞处于哪个群体,再将该群体细胞设门(set gate),进一步分析该群体中的目标细胞。
门(gate)是流式分析过程中一个较为重要的概念,流式分析时有时不希望所有的样品细胞都显示于流式图中,而是希望只显示感兴趣的细胞,排除其他非相关细胞的干扰,使显示的信息更加直观,更具有针对性。例如,分析CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例时,此时可以根据CD4的表达情况,将CD4+T细胞设门显示于一个新的流式图中,则该流式图只显示所设门内的细胞,即只显示CD4+T细胞,其他无关细胞不会被显示。在相应散点图中x轴代表CD4信息,y轴代表CD25信息,这样就可以非常直观地计算出调节性T细胞的比例。说白了就是框定一个区域的细胞,让计算机分析该区域各类细胞的比例。
3.流式等高线图
流式等高线图与流式散点图相似,一张流式等高线图也能同时显示两个通道的信息,所不同的是,流式等高线图借助地理等高线图表示细胞的密集程度,流式等高线图的环线代表的是细胞密度相同的区域,所以,等高线越密集的地方表示此区域细胞密度变化越快,环线的中央区域代表细胞聚集的中心。
流式等高线图的意义和实际应用与流式散点图较为相似,可以看作是流式散点图的一个变体。相比之下,流式散点图更为直观,所以应用也更为广泛。当然,流式等高线图也有其自身的优点,它较能直观地体现细胞群的集中点,等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点,一般代表一个细胞群,所以在某些情况下,流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。
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