系列文章目录

单细胞测序流程（一）简介与数据下载

单细胞测序流程（二）数据整理

单细胞测序流程（三）质控和数据过滤——Seurat包分析，小提琴图和基因离差散点图

单细胞测序流程（四）主成分分析——PCA

单细胞测序流程（五）t-sne聚类分析和寻找marker基因

本期主讲内容——单细胞的细胞类型的注释

课前了解：GO：是一个数据库，旨在建立一个适用于各种物种的，对基因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO 提供了一系列的语义用于描述基因功能，以及这些概念之间的关系。这些语义分为三种不同的种类：细胞学组件（CC），用于描述亚细胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物等；分子功能（MF），用于描述基因、基因产物个体的功能，如与碳水化合物结合或ATP水解酶活性等；生物学途径（BP:），分子功能的有序组合，达成更广的生物功能，如有丝分裂或嘌呤代谢等。

一、课前准备

之前所使用的数据

R语言的IDE

二、过程

直接运行代码就可以出现结果，但是我们需要了解单细胞注释的目的是什么！

目的：将之前所进行聚类分群的细胞亚群进行注释，以便之后的研究。

注释方法：1.软件注释

2.人工注释

我们这次所进行的注释是通过使用R语言所进行细胞类型的注释。

代码如下：

#if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
#    install.packages("BiocManager")
#BiocManager::install("singscore")
#BiocManager::install("GSVA")
#BiocManager::install("GSEABase")
#BiocManager::install("limma")#install.packages("devtools")
#library(devtools)
#devtools::install_github('dviraran/SingleR')
library(limma)
library(Seurat)
library(dplyr)
library(magrittr)
setwd("文件目录")             #设置工作目录#读取文件，并对重复基因取均值
rt=read.table("geneMatrix.txt",sep="\t",header=T,check.names=F)
rt=as.matrix(rt)
rownames(rt)=rt[,1]
exp=rt[,2:ncol(rt)]
dimnames=list(rownames(exp),colnames(exp))
data=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)
data=avereps(data)#将矩阵转换为Seurat对象，并对数据进行过滤
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = data,project = "seurat", min.cells = 3, min.features = 50, names.delim = "_",)
#使用PercentageFeatureSet函数计算线粒体基因的百分比
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(object = pbmc, pattern = "^MT-")
pdf(file="04.featureViolin.pdf",width=10,height=6)           #保存基因特征小提琴图
VlnPlot(object = pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
dev.off()
pbmc <- subset(x = pbmc, subset = nFeature_RNA > 50 & percent.mt < 5)    #对数据进行过滤#测序深度的相关性绘图
pdf(file="04.featureCor.pdf",width=10,height=6)              #保存基因特征相关性图
plot1 <- FeatureScatter(object = pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt",pt.size=1.5)
plot2 <- FeatureScatter(object = pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA",,pt.size=1.5)
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
dev.off()#对数据进行标准化
pbmc <- NormalizeData(object = pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
#提取那些在细胞间变异系数较大的基因
pbmc <- FindVariableFeatures(object = pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 1500)
#输出特征方差图
top10 <- head(x = VariableFeatures(object = pbmc), 10)
pdf(file="04.featureVar.pdf",width=10,height=6)              #保存基因特征方差图
plot1 <- VariableFeaturePlot(object = pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
dev.off()##PCA分析
pbmc=ScaleData(pbmc)                     #PCA降维之前的标准预处理步骤
pbmc=RunPCA(object= pbmc,npcs = 20,pc.genes=VariableFeatures(object = pbmc))     #PCA分析#绘制每个PCA成分的相关基因
pdf(file="05.pcaGene.pdf",width=10,height=8)
VizDimLoadings(object = pbmc, dims = 1:4, reduction = "pca",nfeatures = 20)
dev.off()#主成分分析图形
pdf(file="05.PCA.pdf",width=6.5,height=6)
DimPlot(object = pbmc, reduction = "pca")
dev.off()#主成分分析热图
pdf(file="05.pcaHeatmap.pdf",width=10,height=8)
DimHeatmap(object = pbmc, dims = 1:4, cells = 500, balanced = TRUE,nfeatures = 30,ncol=2)#1：4是热图分成几个，ncol是分为几列。
dev.off()#每个PC的p值分布和均匀分布
pbmc <- JackStraw(object = pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(object = pbmc, dims = 1:20)
pdf(file="05.pcaJackStraw.pdf",width=8,height=6)
JackStrawPlot(object = pbmc, dims = 1:20)
dev.off()
#
#
##TSNE聚类分析
pcSelect=20
pbmc <- FindNeighbors(object = pbmc, dims = 1:pcSelect)                #计算邻接距离
pbmc <- FindClusters(object = pbmc, resolution = 0.5)                  #对细胞分组,优化标准模块化
pbmc <- RunTSNE(object = pbmc, dims = 1:pcSelect)                      #TSNE聚类
pdf(file="06.TSNE.pdf",width=6.5,height=6)
TSNEPlot(object = pbmc, do.label = TRUE, pt.size = 2, label = TRUE)    #TSNE可视化
dev.off()
write.table(pbmc$seurat_clusters,file="06.tsneCluster.txt",quote=F,sep="\t",col.names=F)##寻找差异表达的特征
logFCfilter=0.5
adjPvalFilter=0.05
pbmc.markers <- FindAllMarkers(object = pbmc,only.pos = FALSE,min.pct = 0.25,logfc.threshold = logFCfilter)
sig.markers=pbmc.markers[(abs(as.numeric(as.vector(pbmc.markers$avg_logFC)))>logFCfilter & as.numeric(as.vector(pbmc.markers$p_val_adj))<adjPvalFilter),]
write.table(sig.markers,file="06.markers.xls",sep="\t",row.names=F,quote=F)top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
#绘制marker在各个cluster的热图
pdf(file="06.tsneHeatmap.pdf",width=12,height=9)
DoHeatmap(object = pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
dev.off()#绘制marker的小提琴图
pdf(file="06.markerViolin.pdf",width=10,height=6)
VlnPlot(object = pbmc, features = c("IGLL5", "MBOAT1"))
dev.off()#绘制marker在各个cluster的散点图
pdf(file="06.markerScatter.pdf",width=10,height=6)
FeaturePlot(object = pbmc, features = c("IGLL5", "MBOAT1"),cols = c("green", "red"))
dev.off()#绘制marker在各个cluster的气泡图
pdf(file="06.markerBubble.pdf",width=12,height=6)
cluster10Marker=c("MBOAT1", "NFIB", "TRPS1", "SOX4", "CNN3", "PIM2", "MZB1", "MS4A1", "ELK2AP", "IGLL5")
DotPlot(object = pbmc, features = cluster10Marker)
dev.off()#
#
#这一章的代码从这里开始###################################07.注释细胞类型###################################
library(SingleR)
counts<-pbmc@assays$RNA@counts
clusters<-pbmc@meta.data$seurat_clusters
ann=pbmc@meta.data$orig.ident
singler = CreateSinglerObject(counts, annot = ann, "pbmc", min.genes = 0,species = "Human", citation = "",ref.list = list(), normalize.gene.length = F, variable.genes = "de",fine.tune = F, do.signatures = T, clusters = clusters, do.main.types = T,reduce.file.size = T, numCores = 1)
singler$seurat = pbmc
singler$meta.data$xy = pbmc@reductions$tsne@cell.embeddings
clusterAnn=singler$singler[[2]]$SingleR.clusters.main$labels
write.table(clusterAnn,file="07.clusterAnn.txt",quote=F,sep="\t",col.names=F)
write.table(singler$other,file="07.cellAnn.txt",quote=F,sep="\t",col.names=F)#准备monocle分析需要的文件
monocle.matrix=as.matrix(pbmc@assays$RNA@data)
monocle.matrix=cbind(id=row.names(monocle.matrix),monocle.matrix)
write.table(monocle.matrix,file="07.monocleMatrix.txt",quote=F,sep="\t",row.names=F)
monocle.sample=as.matrix(pbmc@meta.data)
monocle.sample=cbind(id=row.names(monocle.sample),monocle.sample)
write.table(monocle.sample,file="07.monocleSample.txt",quote=F,sep="\t",row.names=F)
monocle.geneAnn=data.frame(gene_short_name = row.names(monocle.matrix), row.names = row.names(monocle.matrix))
monocle.geneAnn=cbind(id=row.names(monocle.geneAnn),monocle.geneAnn)
write.table(monocle.geneAnn,file="07.monocleGene.txt",quote=F,sep="\t",row.names=F)
write.table(singler$other,file="07.monocleClusterAnn.txt",quote=F,sep="\t",col.names=F)
write.table(sig.markers,file="07.monocleMarkers.txt",sep="\t",row.names=F,quote=F)

三、结果

代码行从

#准备monocle分析需要的文件

这一行开始所产生的文件是下一个章节所用熬的文件和数据，需要记住位置和妥善保存。

这一章节的所有结果都是txt文件，我讲解会用截图进行讲解。

从这张图可以看出每个细胞亚群的细胞类型，比如说10号亚群是B细胞

这个图的命名为CELLann代表着每个样本，每个细胞属于什么细胞类型，对细胞的类型进行注释

这个文件的命名为monocleMarkers.txt，这个文件代表着各亚群中的marker基因

这个文件可以看出每个样品中基因数，UMI数，线粒体数。

结尾

因为这次的结果很多取决于之前的数据，所以必须要把上一届的内容也要用到，我已放进代码块中，如果之前内容已经取得，不想重复获取，只需将之前代码中的PDF开头的代码行到dev.off（）代码行全部删掉，就不会将上一张的图形再绘制出来。
单细胞测序流程（六）单细胞的细胞类型的注释到此就结束了
下一章会讲解单细胞的轨迹分析，这次很多取得的数据都会用于下次课程不要删除哦。
我所做的所有分析与教程的代码都会在我的个人公众号中，请打开微信搜索“生信学徒”进行关注，欢迎生信的研究人员和同学前来讨论分析。
ps：公众号刚刚建立比较简陋，但是该有的内容都不会少。

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