微量样本RNA甲基化m6A技术比较

2024-05-09 12:32:48

在哺乳动物mRNA中，N6-甲基腺苷（m6A）约占所有腺苷的0.2％至0.6％，是丰度最高的mRNA修饰。RNA免疫沉淀后通过高通量测序（MeRIP-seq），是转录组范围内检测m6A修饰位置最为有力的技术方法。

常规免疫沉淀富集需要上百微克的总RNA，这限制了其在许多领域的应用。微量MeRIP技术优化实验过程中的关键参数，包括RNA的起始量，RNA片段化，抗体选择，MeRIP洗涤/洗脱条件，RNA文库构建方法和生物信息学分析流程，实现最低500ng总RNA分析转录组m6A修饰分布。

通过2个肺腺癌（ADC）患者样本测试鉴定出大约12000个高信噪比（S/N）的m6A峰。通过对同一患者样本分析转录组、表观转录组和蛋白质组数据，从m6A水平解释了该肿瘤mRNA表达和蛋白质翻译水平差异的动力学原因。

研究现状

表观转录组学是基于RNA生物化学修饰的，影响转录组功能相关的表观改变，是研究转录后基因表达调控的新方向。迄今为止，已发现150多种RNA修饰。自20世纪70年代第一次发现以来，N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳动物mRNA最丰富的修饰形式之一。近年来研究发现，m6A的修饰位点，功能和分子机制是可逆的，调控是动态控制的，调控RNA生命周期的多个环节，包括RNA剪接，RNA衰减，miRNA前体加工和蛋白质翻译等。

研究发现mRNA动态m6A修饰与干细胞的分化和重编程，热休克应激，DNA损伤应答，性发育以及生物钟的速度密切相关。此外，最近的研究表明，m6A修饰紊乱与癌症的起始和发展密切相关。m6A关键酶的表达，包括m6A形成酶（writers）、识别酶（readers）以及去除酶（erasers）均在多种肿瘤中发生改变。低氧诱导m6A去甲基化酶ALKBH5上调导致干细胞标记基因NANOG的mRNA去甲基，导致的NANOG表达升高，乳腺癌干细胞肿瘤形成能力增加。此外，ALKBH5通过增强FOXM1的mRNA表达，在胶质母细胞瘤增殖和肿瘤发生中也起着重要作用，FOXM1是胶质母细胞瘤干细胞自我更新的关键转录因子。同样，m6A的脱甲基酶FTO和甲基转移酶METTL3分别在急性骨髓性白血病和肺癌中显示出致癌功能。

m6A RNA免疫沉淀后进行二代测序（m6A MeRIP-seq）可以在转录组范围内鉴定m6A修饰。在人类细胞中，已鉴定出超过10000个m6A修饰位点分布在大约7000个蛋白质编码基因和非编码RNA的转录本中。尽管在过去的几年中已经对该技术进行了数项改进，并且已有商业化m6A MeRIP试剂盒，RNA的起始量仍需要数百微克。这限制了m6A表观转录组分析在临床样本中的应用。因此，尽管m6A是哺乳动物mRNA中最丰富的内部修饰，但是由于缺乏有效的分析方法，m6A修饰在人类疾病中的作用和动力学原因仍然知之甚少。以下通过优化测试MeRIP不同实验参数，包括RNA起始量、RNA片段化、抗体筛选、MeRIP洗涤/洗脱条件、RNA文库构建方法，以及生信分析流程等，运用2ug的肺癌病人肿瘤组织总RNA，检测到12000个高信噪比的m6A富集峰。

洗涤/洗脱条件的优化

化学打断是m6A MeRIP的第一个步骤。高温可使m1A通过Dimroth重排转化为m6A，RNA通过70℃而不是94℃片段化可尽可能降低m1A到m6A的重排转化。此外，为了将RNA起始量降低至微克级别，运用总RNA代替富集后的mRNA进行片段化，并且RNA片段化范围调整为200nt左右，降低样本纯化丢失。将RNA片段化在200nt的回收效率是100nt的近3倍。

目前MeRIP可概括为两种主流技术流程。第一种流程如图1A方法Ⅱ所示，免疫沉淀（IP）富集后，使用低/高盐洗涤，最后洗脱整个抗体-磁珠复合体。第二种流程如图1A方法Ⅲ所示，IP富集后，使用IP反应缓冲液洗涤，最后通过游离m6A竞争性洗脱m6A修饰RNA片段，这种方法在领域内应用广泛。为了比较这两种流程的IP效能，首先使用等量混合的m6A修饰对照RNA(GLuc)和未修饰对照RNA(CLuc)进行MeRIP实验。 GLuc RNA对照是体外以20% m6ATP和80% ATP为底物的转录产物。图1A中的方法Ⅰ作为外加对照，该对照使用NEB抗体，用IP反应缓冲液洗涤并洗脱整个抗体-磁珠复合物。

方法Ⅱ使用低/高盐洗涤，产生较高的信噪比（图1B）。方法Ⅱ中将洗脱的RNA进行两轮IP反应，进一步提高了富集信噪比(图1C)。进一步将32μg人肺癌细胞系A549的RNA样品与0.1f mol的GLuc和CLuc RNA混合，使用方法II进行MeRIP富集，基于已发表数据，将SETD7和GAPDH分别作为阳性和阴性对照，单经一轮IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比都高达100倍左右 (图1D和1E)。经过两轮IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比进一步提升(图1D和1E)，但是产率显著降低约66%。

图1

Anti-m6A抗体对m6A MeRIP效率影响对比

为进一步比较m6A抗体的保真度，选择Synaptic Systems (SySy)，NEB和Millipore三个公司的抗体用于对比。每个IP富集的RNA投入量为32μg的A549细胞系总RNA混合0.1f mol的GLuc和CLuc RNA对照。SySy抗体富集RNA的产量是NEB或Millipore的两倍。三种抗体富集，通过GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH测定的信噪比值均较高，而NEB和Millipore的比值均在100以上（图2A）。

IP富集RNA建库试剂盒选取

分析市面上RNA测序文库制备试剂盒后，选用Takara/Clontech公司的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)用于文库构建。该试剂盒使用针对哺乳动物rRNA逆转录和扩增后cDNA的特异性探针去除核糖体cDNA，极大降低了低起始量RNA片段化前，直接进行rRNA去除或poly(A) 尾富集过程中的RNA丢失。该试剂盒成功用于上述三种抗体IP富集RNA和input RNA的文库构建。三种抗体富集测序数据中，SETD7基因转录本的信噪比趋势跟RT-QPCR结果相一致（图2B）。每个文库大约检测到13000个m6A峰，每个基因平均有3个峰。约60%的m6A峰在3种抗体富集文库中重叠（图2C）。3种抗体富集文库测序数据量达到20 M的Reads时，检测峰的数量达到平台期（图2D）。m6A峰主要分布在转录本的终止密码子附近。3种抗体m6A富集在5种基因组元件中的比例相似（图2E），m6A信号在终止密码子附近富集（图2F）。此外，Millipore和NEB抗体m6A富集具有“GGAC”基序特征（图2G）。另外，32ug起始RNA文库数据与300ug总RNA起始的m6A文库数据相当。

图2

不同RNA起始量MeRIP-seq结果比较

使用Millipore抗体测试不同起始量总RNA (32ug、12ug、6ug、2ug、1ug和0.5ug)的m6A MeRIP效率。SETD7/GAPDH信噪比随着总RNA起始量的减少而逐渐降低，重复性如0.5ug总RNA起始展示的，呈现较好（r=0.9）。提高RNA的起始量可相应增加m6A检测峰的数量，除了0.5ug RNA外，检测峰的数量均在20M左右的测序数据下达到平台期，而0.5ug总RNA的富集在10M左右即到达平台期（图3A）。与2ug总RNA富集相比，32ug，12ug和6ug总RNA富集测序，随着RNA起始量的提升，m6A唯一检测峰的数量随之增加（图3B）。此外，在32ug起始RNA富集文库中，m6A重叠检测峰相关基因（N=1579）的平均表达水平显著高于m6A唯一检测峰相关基因（N=2168）的平均表达水平（图3C），表明低丰度m6A修饰RNA峰可以通过增加RNA起始量通过MeRIP测序检测出来。

2ug总RNA起始检测到的终止密码子附近m6A峰和m6A修饰核心基序特征与高起始RNA富集相似（图3D）。2ug文库数据特征也与300ug RNA常规富集对照数据相似。2ug总RNA分别使用5ug、1ug和0.2ug Millipore抗体进行富集，结果显示降低抗体的量会升高信噪比，但是富集到的RNA产量也会降低。

图3

参考文献

Zeng Y, Wang S, Gao S, et al. Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials.[J]. PLOS Biology, 2018, 16(9).
Batista P J. The RNA Modification N6-methyladenosine and Its Implications in Human Disease[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2017, 15(3): 154-163.
Yue Y, Liu J, He C, et al. RNA N6-methyladenosine methylation in post-transcriptional gene expression regulation[J]. Genes & Development, 2015, 29(13): 1343-1355.

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