编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。转载来源《微生态》公众号

导读

次级代谢产物深刻影响着微生物生理、代谢和应激反应。越来越多的证据表明，这些分子可以调节微生物对常用抗生素的敏感性；然而，次级代谢产物通常不包括在标准抗菌药物敏感性分析中。这可能部分解释了为什么产生次级代谢产物的各种条件致病菌感染通常在临床抗菌药物敏感试验结果和临床治疗结果之间存在差异。本篇综述中探讨了哪些类型的次级代谢产物会改变抗生素敏感性，以及这种现象是如何发生和为什么发生的。本文讨论了条件致病菌和肠道病原菌自身产生或暴露于其邻近物种产生的分子的例子，以及这些分子对某些抗生素的耐受性和耐药性产生的细微影响。

论文ID

原名：From the soil to the clinic: the impact of microbial secondary metabolites on antibiotic tolerance and resistance

译名：从土壤到临床：微生物次级代谢产物对抗生素耐受性和耐药性的影响

期刊：Nature Reviews Microbiology

IF：60.633

发表时间：2021.9.16

通讯作者：Dianne K. Newman

通讯作者单位：美国加州理工学院生物与生物工程部

DOI号：10.1038/s41579-021-00620-w

综述目录

1 前言

2 外排系统的诱导

3 氧化应激的调节

3.1 抗氧化应激防御上调

3.2 ROS解毒

3.3 次级代谢产物与抗生素的协同作用

4 种间抗生素恢复力

5 对耐药性变迁的影响

6 结语和未来研究方向

主要内容

1 前言

大量的生物体，其中许多来自土壤，产生各种各样的分子，这些分子被归类为“次级代谢产物”，它们可以由真核生物(如植物和真菌)、细菌和古菌产生，通常被定义为不直接支持生产者生长或发育的有机化合物。在浮游微生物培养中，一旦倍增时间减慢，次级代谢产物通常在稳定生长期产生。因此，这些化合物多年来一直被认为是新陈代谢的废物。然而，在过去的二十年中，微生物次级代谢产物的生物学功能出现了更微妙的观点。事实上，“secondary”有点用词不当，因为这些分子已被证明在对微生物生存至关重要的多种生理过程中发挥关键作用，包括但不限于营养物质(如铁或磷酸盐)的获取、细胞信号传递和缺氧状态下的能量保存。

除了具有这种多效性益处外，许多微生物次级代谢产物对其生产者和邻近的生物体都是有毒的。因此，从20世纪早期盘尼西林和链霉素的发现开始，抗生素的开发管线推动了大多数次级代谢产物的表征和纯化工作，这不足为奇。大多数现代临床抗生素都是来源于土壤微生物的天然产物的衍生物，土壤-临床轴继续激励天然产物化学家寻找和设计新药。然而，微生物学家忽视了这一流程可能产生的意外后果，特别是抗生素对在同一环境中进化的条件致病菌的效力。微生物很少(如果有的话)是独立存在的，因此微生物群落中次级代谢产物的存在对其生产者和非生产者施加进化压力，以发展抵御它们的方法，这些防御反过来又会对临床抗生素产生连带作用。

在本篇综述中，我们强调了越来越多的证据将细菌次级代谢产物与抗生素耐受性(即在短暂抗生素暴露下存活的能力)和耐药性(即在给定浓度的抗生素存在下生长的能力)现象联系起来。我们还使用更通用的术语“抗生素恢复力”，指细菌种群对抗生素治疗的耐受能力，这可能是由于耐受性和/或耐药性的增加而引起的。以条件致病菌或肠道病原菌产生的次级代谢产物为例(表1)，我们讨论了这些分子在单物种和多物种微生物群落中改变抗生素疗效的共同作用模式。具体而言，我们指出应注意调节多药耐药外排系统的次级代谢产物，其通过与活性氧(ROS)的相互作用调节抗生素的毒性，以及次级代谢产物诱导抗生素耐受的潜力为抗生素耐药性变迁提供了一条被忽视的途径。虽然细菌次级代谢产物对感染治疗结果的影响尚未在临床研究中得到解决，但体外数据表明，在多种次级代谢产物存在的情况下，抗生素敏感性的变化强烈表明，这些分子在许多机会性感染和慢性感染的防御中可能是一个被低估的因素。我们为未来的实验提供了建议，以探索这些观察结果的相关性(BOX 1)，并讨论了次级代谢产物产生对抗生素耐药性诊断的影响(BOX 2)。最后，我们考虑如何利用次生代谢产物与抗生素疗效之间相互作用的知识来优化现有抗菌药物的使用，产生新的治疗策略靶点。

表1 条件致病菌或肠道病原菌产生的次生代谢产物及其对抗生素疗效的影响。

HQNO，2-n-庚基-4-羟基喹啉-N-氧化物；ND，这些分子对抗生素的影响还没有直接测试过；PCA，吩嗪1-羧酸；PCN，吩嗪1-甲酰胺；PQS，假单胞菌喹诺酮信号；PYO，绿脓菌素；ROS，活性氧。^a对于氨基糖苷类，PYO已被证明可以增加或降低抗生素恢复力，这取决于研究条件。^b分子可能影响敏感性的假设机制。

BOX 1 建立次级代谢产物产生与抗生素耐受性或耐药性增加之间因果关系的指南。

我们提出了几个步骤来研究次级代谢产物介导的抗生素敏感性变化：

确定候选次级代谢产物。这可以通过多种方式实现，包括基于分子结构或其对细胞的生理影响。基因组分析还可以揭示病原菌产生的潜在相关次生代谢产物。研究人员应调查所关注的假定次级代谢产物是否对生产者有任何毒性，以及暴露于其后所引起的分子反应。例如，PYO对分泌细胞具有毒性，结构上与氟喹诺酮类药物相似(图1b)，并诱导外排系统，这一事实导致了对该代谢产物如何降低对这些药物的敏感性的预测。转录组学方法可以用来揭示特定次级代谢产物引起的反应。重要的是，通常需要构建一个突变菌株作为阴性对照，该菌株缺乏产生次级代谢产物的生物合成基因。

检测次级代谢产物。由于次级代谢产物的浓度可能影响抗生素敏感性，因此必须采用准确的定量检测方法。可能的检测方法包括紫外或可见光光谱法或质谱法，在分析复杂样品(例如微生物培养物的提取物或临床样品)时，这两种方法都可以与高效液相色谱相结合。研究人员应在相关临床背景下(例如，在感染的痰液、伤口渗出物或粪便样本中)尝试检测次级代谢产物。重要的是，不同患者体内次级代谢产物的浓度可能存在很大差异，这取决于不同的感染参数(例如，感染阶段、引起感染的菌株、存在的细菌细胞数量)。出于这个原因，所提供的指导方针在最初可能对慢性感染病例最有用，在这种情况下，可以使用对患者的纵向监测以及对体内次级代谢产物浓度的重复测量来抑制体外实验(见BOX 2)。

考虑对邻近物种的影响。在多种微生物感染的情况下，考虑次级代谢产物对整个微生物群落的影响也很重要。因此，研究人员应该考虑所研究的感染类型中哪些物种和次级代谢产物生产者一起最常见。然后，研究人员应该进行生产者和非生产者共培养实验，或非生产者分别暴露于受控浓度的次级代谢产物。了解非生产者如何受到影响(包括所涉及的分子机制)对于预测次级代谢产物如何改变微生物群落的整体抗生素敏感性是至关重要的。

检测次级代谢产物对抗生素敏感性的影响。耐受性和耐药性是两种不同的抗生素恢复力模式，应分别进行测试(见图a部分)；前者可以通过测定暂时暴露于抗生素后存活细胞的百分比来衡量，而后者则需要评估在抗生素存在下的生长能力。在多物种群落中，也有各种各样的测定方法用于测试次生代谢产物介导的对药物敏感性的影响(见图b部分)。在液体共培养中，该物种可以在有或没有渗透膜分离的情况下生长，该膜将相互作用限制在可扩散小分子介导的相互作用。对于生物膜，实验可以通过宏观分析(例如，菌落生物膜，物种混合或分离)或微观分析(例如，微流控技术或替代分析，如琼脂块生物膜分析(ABBA)，同时测量微环境变量，如pH值或O₂水平(见图，b部分))。重要的是，在液体培养和生物膜上进行实验的决定可能会影响结果，因为一些次级代谢产物介导的耐受机制是生物膜特有的。例如，次级代谢产物介导的细胞外DNA释放增加，可以刺激生物膜的形成，从而导致耐受性水平的提高。此外，氧化还原活性的次级代谢产物(如吩嗪)，极大地影响了生物膜内的代谢，进而调节了抗菌药物的疗效。相比之下，浮游生物培养为测试特定次级代谢产物介导的反应提供了更好的控制，并且在评估耐药性时可以采用更复杂的方法(如波动试验)，其中，大量平行培养物被镀在选择性培养基上，每个培养物中自发性抗生素抗性突变体的数量作为推导突变率的数学公式的输入值。因此，调查人员应该决定对于特定问题用什么更合适。

图中管或培养皿中的蓝色(a部分)或蓝点(b部分)代表次级代谢产物。

BOX 2 计算AST期间次级代谢产物的产生。

抗菌药物敏感性试验(AST)是临床微生物学的基石，是确定感染治疗方案的传统依据。然而，在许多临床情况下，AST结果与治疗结果之间几乎没有相关性，这可能是因为在某些情况下，标准的AST条件通常排除了次级代谢产物与抗菌药物之间相互作用的检测。临床AST依赖于低细胞密度接种培养物中非增长读数，而次级代谢产物通常在对数期后期或稳定期早期才产生。此外，即使是在多菌感染的情况下，AST也通常在单菌培养物上进行，消除了检测次级代谢介导的种间相互作用的可能性，从而影响抗菌疗效。

我们建议对临床AST方案进行一些推测性但可测试的修改，以帮助解释感染期间产生的微生物次级代谢产物的影响。我们的目的是引发具体的讨论，如何更好地理解次级代谢产物和临床抗生素疗效之间的相互作用，并最终应用于改善治疗结果，同时也认识到这种努力的潜在复杂性。鉴于次级代谢产物可以显著影响抗生素疗效，所提出的修改可能会改善体外AST结果与临床治疗成功之间的实验相关性。然而，除次级代谢产物产生之外的许多因素(例如，生物膜的形成、营养条件和/或宿主来源的分子)也可能在感染期间影响原位抗生素的敏感性。下面提出的方法需要在感染动物模型中进行细化和验证，并最终在临床试验中进行测试，比较患者的结果与使用常规AST进行抗菌药物选择的结果。此外，如果研究表明次级代谢产物相关的修改提高了AST的预测值，那么在广泛应用于临床微生物实验室之前，在成本和通量方面的可扩展性还需要进一步优化。

使用感染微生物或微生物过夜培养物的过滤上清液。通过使用新鲜生长培养基和感染物过夜培养的过滤上清液的混合物建立AST试验，无需修改标准AST方案的其他方面(例如，可见增长作为读数)，即可解释在对数期后期或稳定期产生的任何次级代谢产物的影响。该方法的一个关键优势是不知道产生的次级代谢产物是什么，从而避免了事先了解感染因子生物合成能力的需要，并考虑了多种次级代谢产物的联合效应。然而，这种方法将显著增加产生结果的时间。此外，将用过的上清与新鲜的生长培养基混合，可能会将次生代谢产物的浓度稀释到临床相关水平以下。培养基中各种营养物质的浓度也会受到影响，可能会以不可预测的方式影响不同菌株，这反过来也会影响抗生素敏感性；事实上，生长培养基的选择通常会显著影响最小抑制浓度的测量。

将纯化的次级代谢产物添加到培养物中。如果已知感染菌产生经验证具有临床相关性的特定次级代谢产物(例如，铜绿假单胞菌产生的绿脓菌素(PYO)或大肠杆菌产生的吲哚)，则可以将纯化的次级代谢产物添加到常规AST试验中。这种方法的一个优点是能够控制次级代谢产物的暴露水平，这将使其有可能确保AST试验中的浓度与临床样本中检测到的浓度相似。然而，这种方法要求次级代谢产物必须是商业可获得的或具有经济可行性，以便从培养物中合成或纯化。此外，必须事先了解感染因子的生物合成能力。在这方面的一个重要的提醒是，同一物种内微生物次生代谢产物的产生在不同菌株之间可能存在很大差异。因此，根据菌株或患者样本的平均浓度来确定次级代谢产物的工作浓度，可能会导致在个别病例中对次级代谢产物影响的高估或低估。

根据次级代谢产物的原位水平调整抗生素“断点”指南。对于感染中常见且可以纯化获得的次级代谢产物，体外试验可导致数学模型的发展，将次级代谢产物浓度定量地与生产者对各种抗菌药物的耐药性变化联系起来。一旦在一系列不同的菌株中得到验证，这些模型就有可能对临床医生用来将微生物分类为敏感或耐药的标准“断点”抗生素浓度进行基于次级代谢产物的调整。然后，患者样本中次级代谢产物的定量分析可以与常规AST相结合。这种方法可以考虑到次级代谢产物产生的菌株变异性，避免修改现有AST方案的需要。然而，在某些情况下，这种方法也可能导致对次级代谢产物效应的低估，因为对患者样本中次级代谢产物的大量测量可能会掩盖微米级尺度上的异质性。

如果多个物种是从多微生物感染中共同分离出来的，则它们可以一起生长。一个物种分泌的次级代谢产物可以影响邻近物种的抗菌功效。因此，在多微生物感染的情况下，在AST试验中同时接种多个物种可以提高对抗菌药物整体反应的预测。为了说明次级代谢产物的产生，该方法仍需与其他修改相结合，如上述建议。此外，需要调查和标准化各物种接种的最佳比率。或者，也可以使用直接从患者样本中提取的混合培养物进行AST试验，绕过或与获得和鉴定单个分离株的步骤并行。

2 外排系统的诱导

激活将毒素排出细胞的外排泵是多种细菌在临床抗生素治疗期间繁衍的一种机制。然而，外排泵早在人类使用合成抗生素之前就已存在，因此推测其最初进化是为了运输其他自然发生的底物，如次级代谢产物。外排泵的类型和组件已被广泛研究。在本篇综述中，我们关注的是如何诱导外排系统响应自身产生的次级代谢产物，从而影响致病菌的抗生素耐受性和耐药性(图1a)。我们讨论的例子大多属于抗性-结瘤-细胞分裂(RND)家族的外排系统，但同样的原理在理论上可以适用于由次级代谢产物调节的其他类型的外排系统。重要的是，外排泵在其调节和底物亲和性方面的特异性不同。因此，为了预测次级代谢产物是否会通过诱导特定的外排系统来增加其生产者的抗生素恢复力，必须了解次级代谢产物如何与系统的转录调控相互作用，以及该系统可以运输哪类药物。许多已知的外排调节的次级代谢产物至少有一个芳香环或杂环(图1b)，这可能表明具有这种结构基序的次级代谢产物很有可能通过诱导多药外排系统影响抗生素的恢复力。

在肠道细菌大肠杆菌(Escherichia coli)中，研究得最好的多药耐药外排系统之一是AcrAB-TolC，它具有复杂的调节系统和广泛的底物范围，是一般应激反应的一部分。尽管AcrAB-TolC通常在高固有水平上表达，但许多分子已被证明可以进一步上调其转录，包括自身产生的次生代谢产物，如化合物2,3-二羟基苯甲酸酯，它是铁载体肠杆菌素生物合成的中间体。事实上，2,3-二羟基苯甲酸酯可直接与转录抑制因子MarR结合，调节AcrAB-TolC和氧化还原感应SoxRS调节系统的表达(图1c)。虽然还没有直接测试肠杆菌素或2,3-二羟基苯甲酸酯的产生本身是否增加了抗生素的恢复力，但已经确定的是，AcrAB-TolC对许多类别的临床抗生素提供保护。信号分子吲哚是大肠杆菌自身产生的次级代谢产物的另一个例子，具有外排介导的抗生素敏感性效应。吲哚触发肠道细菌中某些多药外排泵的表达。事实上，突变体亚群产生高水平的吲哚被认为是一种慈善机制，可诱导大肠杆菌群体水平对诺氟沙星和庆大霉素的耐药性，这种次级代谢产物上调了MdtEF-TolC外排系统。有趣的是，一种与鱼类条件致病菌相关的环境分离菌——Shewanella oneidensis的tolC突变体对蒽醌-2，6-二磺酸盐(土壤和沉积物中天然存在的氧化还原活性腐殖质的类似物，类似于含醌的合成抗生素)敏感，这进一步表明结构相似的天然分子和合成分子之间的功能关系可能是相同的。

外排泵还可以针对对其生产者有毒的次级代谢物提供保护，这种作用可能会增强对临床抗生素的恢复力。例如，在条件致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中，氧化还原感应转录因子SoxR(图1c)激活MexGHI-OpmD外排系统的表达以应对吩嗪，吩嗪是一种有毒的、氧化还原活性的、自身产生的次级代谢产物。吩嗪在自然环境(例如，保护植物免受真菌病原体的侵袭)和感染(例如，增加囊性纤维化患者肺部的铜绿假单胞菌毒力)中具有重要作用。吩嗪类色素绿脓菌素(PYO)还诱导铜绿假单胞菌中第二个外排操纵子mexEF-oprN，这与临床相关。使用可降低各种RND外排系统活性的广谱外排泵抑制剂以及缺少mexGHI-opmD操纵子的敲除突变体进行的实验已经证实，外排是铜绿假单胞菌对其自身吩嗪类药物耐受和耐药的主要机制。重要的是，两种吩嗪调节的外排泵也可以转运氟喹诺酮类药物，多项研究报告称吩嗪对氟喹诺酮类药物的疗效有很强的拮抗作用。例如，暴露于PYO(自身产生或外源性添加)的铜绿假单胞菌细胞对氟喹诺酮类药物环丙沙星和左氧氟沙星的耐受性增加。在一项研究中，通过在吩嗪无效突变体中人为过表达MexGHI-OpmD，达到与PYO存在时相似的水平，这表明药物外排驱动PYO介导的氟喹诺酮耐受性增加。有趣的是，除了氟喹诺酮类和氯霉素外，MexEF-OprN还被认为可以运输甲氧苄啶和磺胺甲恶唑，而铜绿假单胞菌对这两种药物具有内在抗性，但对氨基糖苷类药物则没有，对吩嗪类药物则表现出耐药性混合效应。与吩嗪类似，但不同于氨基糖苷类，MexEF-OprN的所有已知抗生素底物至少有一个芳香环(图1b)，这表明对共享结构基序的分析可以预测哪些临床抗生素将受到最大影响。这种结构比较只适用于对底物识别具有相对特异性的外排系统，不适用于输出多种抗生素的外排系统。

除了MexGHI-OpmD和MexEF-OprN外，铜绿假单胞菌至少有9个属于RND家族的外排系统，其中许多系统的结构和生物化学已经被详细研究过。在临床相关情况下，是否有铜绿假单胞菌产生的次级代谢产物调节这些外排系统仍有待确定。然而，值得注意的是，吩嗪并不是铜绿假单胞菌产生的唯一的次级代谢产物，通过诱导外排促进抗生素恢复力的增加。最近的研究表明，次级代谢产物paerucumarin的产生也刺激铜绿假单胞菌中MexEF-OprN外排系统的转录，从而增加对氯霉素和环丙沙星的耐药性。这些发现强调了自身产生的次级代谢产物通过触发外排泵的上调来促进条件致病菌对临床抗生素恢复力的潜力。

栖息在土壤或植物根部的其他细菌条件致病菌也产生次级代谢产物，促进外排，从而降低抗生素敏感性。例如，从囊性纤维化患者身上分离出的几株Burkholderia cepacia复合菌株可以产生水杨酸盐。水杨酸盐具有铁螯合特性，被生产细胞用作铁载体。它还诱导伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)物种的特异性外排系统(例如，Burkholderia cenocepacia的CeoAB-OpcM)，从而导致抗生素耐药性的增加。水杨酸衍生的抗生素耐药性效应不仅仅限于Burkholderia；例如，在肠杆菌(Enterobacteria)中，水杨酸与MarR结合并使其失活，导致外排泵表达上调，从而增加了对多种临床抗生素的耐药性。Burkholderia物种还会产生一些其他次级代谢产物来影响抗生素的恢复力，包括许多天然抗生素，它们在植物宿主定植过程中具有很强的抑制能力。一个有趣的例子是毒黄素，它由几种Burkholderia物种产生，如在囊性纤维化患者中发现的常见物种Burkholderia gladioli。虽然目前尚不清楚毒黄素是否会毒害产生细胞，但它具有氧化还原活性，可能通过产生H₂O₂引起氧化应激，而且它对其他细菌和真菌也是有毒的。更重要的是，与PYO一样，毒黄素诱导一种特定的RND外排系统，即ToxFGHI，用于其输出。目前尚不清楚B. gladioli或Burkholderia属的其他条件致病菌是否在感染过程中产生毒黄素，或者毒黄素诱导的RND外排系统ToxFGHI是否能够运输任何目前使用的临床抗生素；然而，这是有可能的，因为毒黄素和PYO一样，在结构上与氟喹诺酮相似。

最后，我们注意到上述由于次级代谢产物的存在而诱导外排系统的例子都来自革兰氏阴性菌，这是传统上对药物外排进行更详细研究的生物体。然而，一种相关现象已在非致病性革兰氏阳性菌天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中得到证实，该菌产生一种天然抗生素——放线紫红素，刺激类似于输出四环素的转运体的表达。未来应该研究致病性革兰氏阳性菌中次生代谢产物介导的多药外排泵诱导程度及其对抗生素恢复力的影响。综上所述，所讨论的例子突出了细菌次级代谢产物的丰富多样性，这些细菌次级代谢产物在其生产者中诱导外排活性，可能会影响临床抗生素的疗效。

图1 多药耐药外排泵的次生代谢调控。a次级代谢产物诱导外排系统的表达，外排系统输出代谢物。外排泵表达的增加可以通过将药物从微生物细胞中排出，为临床使用的抗生素提供连带恢复力。b已知外排泵调节次级代谢产物和选定的临床抗生素的结构，显示芳香环和/或杂环基序的共同流行。c SoxR调节大肠杆菌和铜绿假单胞菌的外排系统。每个SoxR单体都含有一个铁硫簇，可以被氧化还原活性分子直接氧化，从而导致其对外排系统的激活和转录诱导。在大肠杆菌中(上)，几个分子可以通过激活SoxR来诱导外排系统AcrAB-TolC的转录。注意，acrAB和tolC是分开转录的，这是一个非常复杂的调控系统的简化版本。重要的是，TolC可以与来自不同类别的外排系统组装，如AcrAB-TolC和来自抗性-结瘤-细胞分裂(RND)超家族外排系统、EmrAB-TolC(主要易化子超家族)和MacAB-TolC(ABC超家族)的其他几个外排系统。当研究额外的次级代谢产物如何影响大肠杆菌对抗生素的敏感性时，确定TolC是哪个特异性外排系统的一部分、参与诱导该系统的调控及其底物特异性是很重要的。在铜绿假单胞菌(下图)中，SoxR的激活是由两种内源性吩嗪、5-Me-PCA(未显示)和PYO介导的，并导致外排系统MexGHI-OpmD的诱导。PHZ_ox，氧化态吩嗪；PHZ_red，还原态吩嗪；RAM_ox，氧化态氧化还原活性分子；RAM_red，还原态氧化还原活性分子。

3 氧化应激的调节

十多年前，有人提出，杀菌抗生素发挥其致死作用的部分原因是诱导氧化应激，而与各种抗生素的特定细胞靶点无关。虽然这一假设引起了争议，但其他研究证据表明，杀菌抗生素影响细胞氧化还原状态，由此导致的ROS和氧化应激的增加可导致细胞死亡。重要的是，许多次级代谢产物也与细胞氧化还原稳态和氧化应激反应有关。在本节中，我们讨论了三种不同的作用模式，这些代谢物可以潜在地拮抗或增强临床抗生素的毒性(图2a)：氧化应激反应基因上调；ROS直接解毒；增加内源性ROS的产生。

图2 次级代谢产物与氧化应激的相互作用。a示意图描绘了杀菌抗生素如何通过直接破坏靶向特异性过程和间接促进活性氧(ROS)的形成而导致细胞死亡，这是呼吸作用改变和细胞损伤的结果。次级代谢产物可以在多个点与这些途径相互作用，包括通过干扰呼吸作用和氧化还原稳态，通过氧化还原循环直接产生ROS以及通过单电子反应解毒ROS。促进氧化应激的次级代谢产物可以拮抗或增强抗生素毒性，这可能取决于所导致的ROS增加是适度的(细箭头)还是重度的(粗箭头)。适度的ROS增加可能会诱导保护性的氧化应激反应，从而中和抗生素毒性，而重度的ROS增加可能会压倒细胞防御，从而导致与杀菌抗生素的协同效应。b绿脓菌素(PYO)的氧化还原活性在视觉上显而易见，因为它从细胞还原剂中获得两个电子和两个质子后会发生从蓝色(氧化)到无色(还原)的颜色变化，这种反应在生理条件下是可逆的。c许多氧化还原活性的次级代谢产物在还原(Red)到氧化(Ox)的循环过程中可以向分子氧提供电子，从而形成超氧化物或过氧化氢。细胞可以通过超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和烷基过氧化氢还原酶催化的酶法反应来解毒这些形式的ROS。d细菌氧化应激反应通常通过多种途径进行调节。例如，在铜绿假单胞菌中，H₂O₂感应转录因子OxyR调控过氧化氢酶和烷基过氧化氢还原酶的表达(左)。此外，转录因子铁硫簇调节因子(IscR)上调铁硫簇(isc)操纵子的生物合成，以响应由ROS(如超氧化物或H₂O₂)引起的氧化应激，这会直接损害IscR中的铁硫簇，从而导致其调节子的抑制。

3.1 抗氧化应激防御上调

上调氧化应激反应表达的次级代谢产物可激发细菌细胞对临床抗生素的耐受性和/或耐药性，类似于暴露于亚致死浓度的氧化剂(如H₂O₂)的保护作用。在这类代谢物中，吲哚也许是研究得最好的。如上所述，吲哚还可以通过上调外排泵的表达来影响抗生素敏感性。然而，这种效应被认为主要发生在高浓度吲哚(＞1 mM)下；人类粪便中的吲哚浓度通常较低，尽管已记录测量值为1.1 mM。在这些较低的浓度下，吲哚对其生产者大肠杆菌无毒，但仍然诱导由OxyR调节的氧化应激反应基因，如烷基过氧化氢还原酶、硫氧还蛋白还原酶和DNA结合蛋白Dps。暴露于吲哚会使大肠杆菌对三种不同类别抗生素(氟喹诺酮类、氨基糖苷类和β-内酰胺类)的持续频率增加至少一个数量级，而oxyR的缺失会显著降低这种影响，这表明次级代谢产物对氧化应激反应的上调有助于细菌持续存在。吲哚激活OxyR的分子途径尚不清楚，但在羟基自由基或其他强氧化剂的存在下，吲哚容易发生单电子还原为自由基形式，这表明它可能与呼吸作用产生的内源性ROS相互作用，并可能放大它们。也有人提出吲哚可以破坏膜脂的排列，使呼吸醌与氧气直接相互作用，从而导致超氧化物的生成。

PYO是细菌次级代谢产物诱导氧化应激反应的另一个例子。PYO是一种氧化还原活性代谢物，在生理条件下可以可逆地获得和失去电子(图2b)，除了干扰呼吸作用外，还可以在有氧条件下通过将氧直接还原成超氧化物(图2c)产生ROS。在其产生菌铜绿假单胞菌中，PYO增加超氧化物歧化酶活性，并上调其他几个氧化应激反应基因的转录，包括那些编码烷基过氧化氢还原酶、硫氧还蛋白还原酶、过氧化氢酶和铁硫簇生物发生机制的基因(图2c，d)。有趣的是，PYO已被证明以一种独立于药物外排的方式增加了铜绿假单胞菌培养中庆大霉素耐药突变体的频率，因为PYO不会上调氨基糖苷转运的外排泵。鉴于已知庆大霉素通过与铁形成复合物促进细胞内ROS水平的增加，并且用氧化剂预处理细胞可以使其耐受抗生素，对这种现象的一个合理解释是PYO诱导的氧化应激反应中和了与ROS相关的庆大霉素毒性。这反过来又可以降低自发突变体从种群中随机丢失的比率，这将导致观察到的耐药突变体的频率增加。在其他氨基糖苷类(卡那霉素、链霉素和妥布霉素)和β-内酰胺类抗生素(羧苄青霉素)存在的情况下，PYO也能促进铜绿假单胞菌的生长。与庆大霉素一样，这些抗生素被认为不是PYO调节外排系统的底物，但它们属于已被证明能扰乱细胞氧化还原状态的药物类别，这再次表明观察到的抗生素疗效下降可能与PYO诱导的氧化应激反应有关。

3.2 ROS解毒

与诱导酶促氧化应激反应的产生ROS的氧化还原活性次级代谢产物相反，具有抗氧化活性的次级代谢产物可以通过直接解毒抗生素衍生的ROS来抵御抗生素的攻击。其中一个例子是麦角硫因(ergothioneine)，它与分枝硫醇(mycothiol)一起是分枝杆菌中两种主要的含硫氧化还原缓冲液。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中麦角硫因生物合成基因的缺失降低了利福平、异烟肼、贝达奎啉和氯法齐明的最低抑制浓度(MICs)，此外，野生型在MIC治疗下的存活率至少降低了30-60%。其他具有抗氧化活性的次级代谢产物已被证明对宿主免疫细胞(包括巨噬细胞和中性粒细胞)产生的ROS具有重要抗性。其中一种代谢物是葡萄球菌黄素(staphyloxanthin)，这是一种膜包埋的类胡萝卜素色素，可保护金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)免受ROS的侵害，从而减少中性粒细胞的杀伤。同样，由B族链球菌和牙齿病原菌变异链球菌(Streptococcus mutans)产生的类胡萝卜素也与对ROS的抗性相关。这些色素的抗氧化能力归因于其高度共轭的多烯主链，尽管不同类胡萝卜素清除ROS的确切机制尚不清楚。重要的是，抗氧化剂不一定要位于细胞质中以防止抗生素诱导的ROS积累，因为外源性过氧化氢酶已被证明可以增加暴露于甲氧苄啶后的细菌存活率。因此，尽管大多数关于膜内类胡萝卜素的研究集中在与胞外来源ROS的相互作用上，但这些色素也可能能够抑制杀菌抗生素治疗期间细胞内产生的氧化应激。考虑到越来越多的证据表明氧化还原失衡和氧化应激是许多抗菌药物的下游效应，葡萄球菌黄素或其他膜相关色素促进临床抗生素恢复力的可能性值得进一步研究。

除了上述例子外，某些微生物产生的化合物并非有代表性的次级代谢产物，因为它们要么是无机物，要么不是正常生长所必需的，它们也通过提高细菌细胞的抗氧化能力来促进抗生素耐受性或耐药性。例如，内源性H₂S可以保护多种细菌(如大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)免受已知会产生氧化应激的抗生素(如庆大霉素)的毒性。这一现象被认为是由H₂S抑制Fenton反应并刺激过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的双重作用机制引起的。多胺还被证明可以通过对抗氧化应激来保护细菌免受抗生素毒性，这被认为部分是由于它们具有中和自由基的能力，尽管也可能涉及细胞成分的物理保护和其他氧化应激反应的间接上调。大肠杆菌在有氧条件下暴露于抗生素后会提高腐胺和亚精胺的产生，而这些多胺反过来通过减少ROS的产生和氧化损伤而在统计学上显著提高抗生素治疗下的生存能力。同样，B. cenocepacia分泌的腐胺保护其生产者免受多粘菌素B、诺氟沙星或利福平治疗引起的氧化应激。最后，在铜绿假单胞菌中，BqsRS调节系统通过感知亚铁(在囊性纤维化患者的肺中普遍存在)来增加多胺的产生，从而在多粘菌素和氨基糖苷类等阳离子抗生素存在的情况下提高存活率。总之，这些例子说明了不同细菌代谢产物和氧化应激之间的相互作用如何提高对临床抗生素的恢复力。

3.3 次级代谢产物与抗生素的协同作用

除了次级代谢产物通过减轻氧化应激而降低抗生素疗效的例子外，还需要注意的是，在某些情况下，次级代谢产物增加ROS的生成会放大临床抗生素的毒性。一个例子是2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮，也称为假单胞菌喹诺酮信号(PQS)，由铜绿假单胞菌产生。PQS是一种氧化还原活性分子，不仅能还原自由基，还能还原金属离子，因此具有抗氧化性和促氧化活性，铁的还原通过Fenton反应促进ROS的形成。促氧化活性似乎在细胞中占主导地位，因为PQS诱导氧化应激反应并增加对过氧化氢和环丙沙星的敏感性。PQS的促氧化作用还体现在，PQS的过量产生与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的损害协同作用，增加内源性氧化应激和抗生素敏感性。值得注意的是，消除PQS产生增加了对环丙沙星、亚胺培南和庆大霉素的耐受性。另一种氧化还原活性次级代谢产物是PYO，在一定条件下可增加抗生素敏感性。虽然铜绿假单胞菌预先暴露于PYO会增加对氟喹诺酮类药物的耐受性，并促进庆大霉素耐药突变体的建立，但PYO和其他吩嗪类药物也被证明会增加铜绿假单胞菌对阳离子抗菌肽(包括粘菌素和多粘菌素B)的敏感性。这种协同作用的潜在机制尚未确定，但值得注意的是，多粘菌素B在铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性条件致病菌中促进了严重的氧化应激。此外，与氟喹诺酮类或氨基糖苷类药物不同，阳离子抗菌肽也可渗透外膜，从而可能增加吩嗪的吸收，从而进一步加速ROS的产生。因此，吩嗪和阳离子抗菌肽之间的协同作用可能最终由压倒性的氧化应激级联驱动。鉴于ROS产生的次级代谢产物在不同情况下可以增强或削弱抗生素的疗效，未来的研究应侧重于揭示感染期间哪些影响优先，这对于更好地理解此类次级代谢产物如何影响临床治疗结果至关重要。

4 种间抗生素恢复力

到目前为止，我们已经讨论了一些次级代谢产物的例子，这些次级代谢产物已知会影响其生产者对临床抗生素的敏感性，或基于其与既定抗生素耐药机制的相互作用而具有潜在的影响。同样重要的是，许多次级代谢产物，特别是那些分泌的代谢物，也可以调节种间抗生素恢复力(图3)。事实上，多种微生物感染成员之间的相互作用如何影响抗生素治疗结果最近受到了广泛关注。

尽管我们对可交换次级代谢产物如何影响群落水平抗生素恢复力的理解仍处于起步阶段，但已经有一些关于这一主题的报道。例如，吲哚已被确定为大肠杆菌和Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium之间抗生素耐受性的种间调节剂。鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)在感染期间可能与共生大肠杆菌相互作用，不产生吲哚，但在添加外源性吲哚的情况下以及与产生吲哚的大肠杆菌共培养时，其对环丙沙星的耐受性增加了三倍以上。与其在大肠杆菌中的作用类似，吲哚诱导鼠伤寒沙门氏菌中OxyR调节的氧化应激反应，并且oxyR的缺失消除了吲哚介导的环丙沙星耐受性的增加。有趣的是，吲哚也被报道增加了吲哚非产生菌铜绿假单胞菌对氨苄青霉素的耐药性，不是通过诱导氧化应激反应，而是通过刺激外排泵和染色体β-内酰胺酶的表达。这些例子强调了分泌的次级代谢产物对邻近物种的抗生素恢复力具有保守和机械性差异化影响的潜力。

除吲哚外，其他次级代谢产物已显示出作为抗生素恢复力的种间调节剂的潜力。例如，由B. cenocepacia分泌的腐胺对多粘菌素B的保护作用不仅延伸到生产者，而且还延伸到共培养的邻近物种，如大肠杆菌和铜绿假单胞菌。同样，P. aeruginosa产生的PYO显著增加了多种临床相关Burkholderia物种在共培养中对环丙沙星的耐受性。在另一种条件致病菌鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)中，暴露于PYO可能通过上调超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，使阿米卡星和羧苄青霉素持续频率增加3-4倍。最后，铜绿假单胞菌产生的群体感应信号诱导白色念珠菌(Candida albicans)对氟康唑产生耐药性，这表明细菌次生代谢产物不仅可以介导种间效应，还可以介导对抗菌功效的跨界效应。到目前为止，这些相互作用只在体外得到了证实。然而，鉴于Burkholderia、不动杆菌(Acinetobacter)和病原真菌都可以在慢性感染中与铜绿假单胞菌一起发现，这些结果表明，未来的研究可以从次级代谢产物介导的种间诱导抗生素恢复力的体内相关性中获得有价值的见解。

重要的是，尽管上述例子表明，某些分泌的次级代谢产物有可能提高多菌感染中整个群落的抗生素恢复力水平，但在一个物种中促进抗生素恢复力的次级代谢产物并不总是在其他物种中发挥作用。一个关键的考虑因素是，为了使次级代谢产物触发对临床抗生素恢复力的跨物种诱导，非生产物种必须能够耐受次级代谢产物引起的任何压力。如果毒性超过了防御诱导或抗生素解毒的益处，非生产物种将不会获益。事实上，次级代谢产物可能与临床抗生素起协同作用。在金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌之间发现了这种相互作用的例子，这两种细菌经常在囊性纤维化患者中同时出现。金黄色葡萄球菌对铜绿假单胞菌分泌的几种次级代谢产物敏感，其中一些可增加金黄色葡萄球菌对临床抗生素的敏感性。例如，铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂通过增加膜通透性增强妥布霉素对金黄色葡萄球菌的毒性。另一种铜绿假单胞菌产生的次级代谢产物，2-n-庚基-4-羟基喹啉-N-氧化物(HQNO)，最近被证明通过类似的机制提高了金黄色葡萄球菌生物膜对氟喹诺酮类药物和膜靶向抗生素的敏感性。然而，铜绿假单胞菌次生代谢产物对金黄色葡萄球菌的毒性作用并不总是与临床抗生素协同作用。通过抑制生长，HQNO促进了金黄色葡萄球菌生物膜对靶向细胞壁合成和蛋白质合成的抗生素的耐受性，这与它对其他抗生素的作用相反。相反，在金黄色葡萄球菌的浮游培养中，HQNO可以通过抑制呼吸作用和消耗细胞内ATP诱导多药耐药性。PYO对金黄色葡萄球菌呼吸作用的干扰同样选择了非呼吸性小菌落突变体，这些突变体通常对抗生素治疗具有耐药性。在这种情况下，一个物种产生的不同次级代谢产物似乎对邻近物种具有相互冲突和条件依赖性影响，体内研究和共培养实验对于确定对临床抗生素疗效的总体影响尤为必要。

铜绿假单胞菌产生的次生代谢产物可能对另一种条件致病菌嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的抗生素恢复力产生复杂的影响。与在环丙沙星治疗期间暴露于PYO获益的B. cepacia复合体成员相比，S. maltophilia对PYO毒性更敏感，在低至50 μM的浓度下表现出生长抑制。在较低但仍然致命的环丙沙星剂量下，浓度达50 μM的PYO在统计上显著增加了S. maltophilia的存活率，这表明PYO确实诱导了该物种对氟喹诺酮类药物的防御。然而，在10倍高剂量的环丙沙星下，即使是10 μM的PYO也是有害的。值得注意的是，尽管原位PYO水平在感染铜绿假单胞菌的患者之间存在很大差异，但已在感染者的痰液和伤口渗出液中检测到PYO的浓度分别高达130 μM和0.31 mg g^-1。因此，PYO和S. maltophilia的例子表明，在多微生物感染期间，为了预测次级代谢产物将如何影响整个群落对临床抗生素的恢复力水平，必须在次级代谢产物和临床抗生素的一系列临床相关浓度范围内表征种间效应的方向性和大小。

图3 次级代谢产物作为抗生素恢复力的种间调节剂。多种微生物感染中次生代谢产物生产者的存在可以改变群体对抗生素治疗的敏感性。当生产者不存在时(a部分)，抗生素治疗的整体恢复力水平较低。然而，通过次级代谢产物(b部分，蓝色背景)的分泌，生产者(绿色细胞)的存在可以对不同的群落成员产生不同的影响。对于对次级代谢产物(黄色细胞)具有内在抗性的成员，分子的存在可以增加对抗生素治疗的恢复力。然而，如果一个成员对次级代谢产物(紫色细胞)敏感，增加的毒性会压倒细胞防御，增强临床药物的杀伤作用。

5 对耐药性变迁的影响

近年来，人们越来越认识到抗生素耐受性不仅会直接导致感染治疗失败，还会促进可遗传耐药突变的建立。对抗生素耐受性与耐药性变迁之间关系的探索，主要集中在临床抗生素治疗所选择的自发突变导致的耐受性。然而，条件致病菌产生的至少一种次级代谢产物，即PYO，也已证明对可遗传耐药突变的建立有影响。基于经典波动试验的结果表明，PYO不仅提高了生产者(铜绿假单胞菌)的耐药突变率，而且还提高了一种共现机会菌(Burkholderia multivorans)的临床分离株的耐药突变率。值得注意的是，PYO对获得遗传抗性的影响因不同种类的抗生素而异。特别是，观察到对PYO诱导的防御产生更高耐受性的药物具有强烈的作用，这表明这种现象确实是由耐受性驱动的，而不是PYO的诱变效应。值得注意的是，在B. multivorans中，PYO治疗增加了其对环丙沙星耐药性的突变率，达到了与临床高突变菌株相媲美的水平。此外，在铜绿假单胞菌和B. multivorans中，即使没有持续暴露于高水平的PYO，在抗生素治疗前用PYO预处理足以提高耐药突变体的形成率。这些发现共同揭示了耐受性诱导的次级代谢产物对抗生素耐药性变迁的重大影响。然而，未来的实验有必要研究这些观察结果的临床相关性，以及PYO暴露引发的耐受性和耐药性之间的联系是否可以推广到其他次级代谢产物仍有待确定。

结语和未来研究方向

虽然细菌次级代谢产物的产生或暴露与临床抗生素恢复力之间的直接联系仅在少数研究中被探究，但已知更多的次级代谢产物与抗生素耐受性和耐药性相关的细胞功能相互作用，特别是药物外排和氧化应激反应。我们希望本综述中讨论的例子能够促进对这些和相关次级代谢产物改变临床抗生素疗效的条件的进一步研究，特别是在感染治疗期间。目前，PYO是关于这一话题有最详细证据的次级代谢物，可能是由于其生产者铜绿假单胞菌得到了广泛的研究关注。然而，我们预计，在广泛的条件致病菌中有意寻找此类分子(BOX 1)将会发现更多尚未鉴定的次级代谢产物，这些代谢物有可能会影响抗生素治疗结果。土壤携带的条件致病菌通常具有产生多种次生代谢产物的生物合成能力，这可能是因为它们必须应对土壤环境的异常复杂性和异质性。在大多数情况下，这些次级代谢产物的生物学功能以及它们是否在感染期间产生仍然是未知的。然而，次级代谢产物的生物合成基因簇通常位于编码外排泵的基因附近或与这些基因共转录，而且许多微生物次级代谢产物具有氧化还原活性，因此有可能产生或解毒ROS，这表明，与临床抗生素疗效的相互作用可能比目前所认知的要普遍得多。

重要的是，了解次级代谢产物引发细胞反应的分子机制，以及次级代谢产物本身的化学性质，可以为哪些临床抗生素可能受到影响提供实际的见解。有了这些知识，再加上对影响抗生素敏感性的其他环境和生理因素的了解，我们认为有可能优化现有抗生素的使用，以更好地降低治疗失败的风险，并防止体内耐药性变迁。例如，如果一种病原菌产生一种次级代谢产物，这种代谢物上调氟喹诺酮类和其他芳香分子的外排泵，那么使用另一类对这种防御不敏感的抗生素(如氨基糖苷类)成功治疗的机会可能会更高。这些次级代谢产物的生物合成途径，甚至分子本身，也可以作为开发抗微生物药物佐剂的新靶点。目前已经在研究PYO和葡萄球菌黄素等次级代谢产物，它们也被认为是毒力因子。例如，酶法去除PYO增加了体外抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的杀伤作用。此外，在体外和小鼠感染模型中，抑制产生H₂S的细菌酶可以提高杀菌抗生素的效力。这些结果鼓励进一步探索靶向特定细菌代谢物的产生或存在是否可以优化感染治疗的临床疗效。最后，重新调整临床抗菌药物敏感性试验方案以考虑次级代谢产物对抗生素疗效的影响(BOX 2)，可能会提高这些检测的预测值，特别是产生次级代谢产物的条件致病菌，例如B. cepacia复合体的成员通常在体外MIC测量和临床治疗结果之间表现出差异。

总之，通过反思过去，对于我们在未来应对抗生素耐受性和耐药性带来的棘手挑战的能力大有裨益。天然抗生素的进化和生态历史与临床抗生素发现的历史直接相交。尽管土壤继续在为天然产物的开采提供丰富的资源，但人们忽略了这样一个事实：在合成这些分子的途径进化的同时，其他途径也在共同进化以响应它们。记住这一共同的历史背景对于预测次级代谢产物如何影响多种微生物群落对常规抗生素的反应很重要，并促使人们创造性地思考调控这种反应的新方法。

Elena K. Perry, Lucas A. Meirelles, Dianne K. Newman. 2021. From the soil to the clinic: the impact of microbial secondary metabolites on antibiotic tolerance and resistance. Nature Reviews Microbiology https://doi.org/10.1038/s41579-021-00620-w

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