山茶花粉中咖啡因酪氨酸酶抑制剂活性的研究

摘要：酪氨酸酶抑制剂对黑色素生成的具有调节的作用，因此在化妆品，医疗和食品行业中很重要。使用高速逆流色谱法和高效液相色谱法从山茶花粉中分离纯化酪氨酸酶抑制剂，并通过NMR和质谱鉴定为咖啡因。在非竞争性模型中显示出较强的蘑菇酪氨酸酶抑制活性，IC50值为18.5 ± 2.31μg/mL。咖啡因不与酶活性中心的铜离子相互作用，但可以抑制酪氨酸酶的荧光强度，改变该酪氨酸酶的二级构象。分子动力学模拟表明，咖啡因通过Lys379、Lys376、Asp357、Glu356、Thr308、Gln307、Asp312和Trp358与酪氨酸酶结合，从而改变了L-酪氨酸的结合位点和活性中心附件的环状构象。体外细胞模型分析显示，咖啡因对B16-F10黑色素瘤细胞的细胞内酪氨酸酶活性和黑色素生成均有显著的抑制作用，且呈浓度依赖性。这些结果表明，咖啡因是一种强大的酪氨酸酶抑制剂，在化妆品和制药行业中具有开发成皮肤增白剂或在食品行业中用作抗褐变剂的潜力。

分子对接(Molecular docking)是基于结构药物设计的核心模拟手段，依据受体与配体作用时的几何匹配和能量匹配过程，模拟受体-配体相互作用，预测两者间最佳的结合模式和结合亲和力。采用分子对接模拟技术，科研人员可以进行基于结构的药物虚拟筛选，药物分子的结构改造，配体和受体相互作用的机理研究等工作，从而大大提高实验效率。在Discovery Studio这一分子模拟的综合平台中，分子对接程序包含Libdock、CDOCKER、Flexible Docking，这三种对接算法各有优势，能够满足广大科研工作者的多种应用需求，为其提供配体受体间相互识别的“利器”。

山茶花粉中咖啡因酪氨酸酶抑制剂活性的研究

Ref：Journal of Agricultural and Food Chemistry. Accepted: October 29, 2019, IF=4.192

链接：http://dx.doi.org/10.1021/acs.jafc.9b04929

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1）)是调节黑色素合成途径的关键酶，它参与各种生理代谢过程和疾病，包括衰老，恶性癌症和神经退行性变。在正常生理条件下，黑色素是由酪氨酸酶通过将L-酪氨酸转化为醌而产生的，是保护皮肤免受紫外线照射的光保护因子。但是，黑色素的过量产生会导致各种皮肤疾病，例如老年斑、雀斑、黄褐斑，炎症后的黑色素瘤，甚至是恶性黑色素瘤。此外，酪氨酸酶可以催化生物活性成分的氧化并导致水果、蔬菜和蘑菇的褐变，导致营养价值和感官特性的丧失。因此，酪氨酸酶抑制剂具有美白皮肤和抑制酶促褐变的潜力，因此在化妆品和食品的研究领域引起了极大的关注。

在本研究中，主要是先使用高速逆流色谱(HSCCC)和高效液相色谱(HPLC)从山茶花粉中分离纯化酪氨酸酶抑制剂，并通过NMR和质谱鉴定为咖啡因；然后用动力学分析中表征抑制作用；再利用紫外可见光、荧光和圆二色性(CD)光谱分析研究抑制剂对酪氨酸酶的作用；最后通过计算模拟的方法研究酪氨酸酶与抑制剂之间的相互作用，在分子水平上阐明酪氨酸酶抑制剂的抑制机理。

分子对接结果显示，酪氨酸酶与L-酪氨酸(底物)和咖啡因的结合能分别为5.5和6.0 kcal/mol，表明咖啡因与蘑菇酪氨酸酶的结合比底物更紧密。根据咖啡因存在和不存在时蛋白结构的叠加比较，咖啡因在活性中心以外且远处的一个位点与酶结合，并且远离铜离子，表明咖啡因不直接作用于铜离子或与配体竞争。此外，咖啡因会稍微改变铜离子的位置以及与活性中心相邻的环的构型。在没有咖啡因的情况下，L-酪氨酸与His85和Gly86通过氢键相互作用；而与Val283、His259、His244、Glu256、Pro284、Asn243、His94、Phe90、His61、Leu63、His85和Gly86通过范德华力相互作用；与Cu400通过金属相互作用；Phe90和His244通过疏水相互作用；而与Asn243通过碳氢键。当将咖啡因添加到酪氨酸酶和L-酪氨酸复合物中时，结果显示咖啡因与酪氨酸酶的氨基酸残基Lys379和Lys376形成氢键；通过与Asp357、Glu356、Thr308、Gln307和Asp312形成范德华力；并与Trp358通过疏水相互作用。而L-酪氨酸通过范德华力与His85、Glu256、His259、His263、His296、Gly58、Gly62、Ala287和Tyr97结合；通过金属相互作用的Cu400和Cu401，并与Phe292和His61通过疏水相互作用。结果显示，咖啡因改变了L-酪氨酸与酪氨酸酶结合的氨基酸残基和结合力，并且咖啡因与酪氨酸酶的结合位点与以前报道的抑制剂不同。与其他酪氨酸酶抑制剂相比，咖啡因是一种常见的天然化合物，来源广泛，具有多种活性。研究结果为利用咖啡因防止黑色素的过度生成提供了科学依据，可以促进普通人群的抗衰老、美白，也可以作为食品中的抗褐变剂，进一步提高咖啡因甚至茶花粉在多个领域的实际应用。

图1 无咖啡因(蓝色)和有咖啡因(紫色)时蘑菇酪氨酸酶结构的叠加

图2 咖啡因和L-酪氨酸与蘑菇酪氨酸酶相互作用图。

无咖啡因情况下L-酪氨酸与酪氨酸酶相互作用图3D(A)和2D (B)；咖啡因与酪氨酸相互作用图3D (C)和2D (D)；在咖啡因存在情况下，L-酪氨酸与酪氨酸酶的相互作用图3D (E)和2D (F)。

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我们的研究结果进一步在分子水平上深入了解了咖啡因对酪氨酸酶的抑制机制。咖啡因对B16-F10黑素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素生成的抑制作用呈浓度依赖性。我们的发现可能有助于揭示咖啡因和蘑菇酪氨酸酶之间的结构功能相互作用，并进一步提高咖啡因甚至茶花粉在化妆品和制药工业中作为皮肤增白剂或在食品工业中作为抗褐变剂的实际应用。

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