mRNA免疫荧光实验

1.免疫荧光概念

免疫荧光 (Immunofluorescence，IF) 是一种重要的免疫化学技术，可以检测和定位各种细胞制剂的不同类型组织中的各种抗原。

图1：免疫荧光原理

2.免疫荧光的种类
根据实验范围或使用的特定抗体，目前有三种方法：直接法、间接法和补体结合技术。

2.1直接法

初级或直接免疫荧光使用与荧光团化学连接的单一抗体。抗体识别目标分子并与其结合，其携带的荧光团可以通过显微镜检测。由于抗体与荧光团的直接结合，这种技术比下面的间接方案有几个优势。这减少了染色过程中的步骤，使过程更快，并且可以通过避免抗体交叉反应或非特异性的一些问题来减少背景信号。然而，由于可与一抗结合的荧光分子数量有限，直接免疫荧光不如间接免疫荧光敏感。

图2：直接免疫荧光

2.2间接法

二级或间接免疫荧光使用两种抗体；未标记的第一抗体特异性结合目标分子，而携带荧光团的二抗识别一抗并与之结合。多个二抗可以结合一个一抗。这通过增加每个抗原的荧光团分子数量使信号放大。该方案比上面的直接方案更复杂和耗时，但它具有更大的灵活性，因为多种不同的二抗和检测技术可用于给定的一抗。

图3：间接免疫荧光

2.3补体结合技术

补体结合 IIF 技术是一种非常灵敏的三步血清学技术。通过这种方法，非常少量的循环抗体可以通过它们对补体的高亲和力来检测。可以使用 FITC 标记的抗补体来证明补体。该技术比常规 IIF 更敏感，因为通过将一个以上的补体分子与每个免疫球蛋白 (Ig) 结合实现扩增，并随后显示多个补体分子。

图4：补体结合技术

3.免疫荧光的优缺点

3.1优点
（1）简单且可重现
（2）1-3小时的短程序时间
（3）高灵敏度
（4）重要的预后价值，特别是对于疱疮病例

3.2缺点
（1）自发荧光
（2）荧光重叠
（3）非特异性荧光
（4）有时多聚化或影响靶分子的动力学和表达水平

4.免疫荧光的应用

免疫荧光在自身免疫性疾病研究；定义亚细胞水平的抗原-抗体相互作用；识别病毒、原生动物、细菌和寄生虫抗原；识别小细胞表面结构，例如淋巴细胞上的受体等领域有广泛应用。

5.卡梅德生物可以提供高质量的免疫荧光技术服务

卡梅德生物（KMD Bioscience）可以提供高质量的免疫荧光技术服务，并提供技术支持。免疫荧光技术的主要流程如下：标本制备、固定、透化、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光检测。

5.1标本制备

5.1.1为增加细胞粘附，在室温下用 1:10 稀释的聚赖氨酸溶液处理盖玻片 5 分钟。
5.1.2以适当的稀释度接种细胞并生长直至细胞达到所需的汇合度 (~70%)
5.1.3在 PBS 中短暂冲洗细胞。

5.2固定

5.2.1吸出 PBS，用含甲醛的 PBS 覆盖细胞（在通风橱中工作）。让细胞在室温下固定 15 分钟。
5.2.2吸出固定剂，在 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

5.3透化（可选）

甲醇和丙酮固定产生透化细胞制剂。对于多聚甲醛固定制剂，用 Triton X-100 处理 5 分钟或用甲醇处理 5 分钟。
5.3.1甲醇透化步骤：甲醛固定后，用冰冷的100%甲醇覆盖细胞（用量足以完全覆盖细胞至3-5mm深度，不要让细胞干燥），细胞在甲醇中冰箱孵育10分钟。
5.3.2在 PBS 中冲洗 5 分钟。

5.4封闭

5.4.1在 PBS、Triton X-100 中的 5% 正常血清中作为二抗（例如正常山羊血清、正常驴血清）封闭样品 1 小时。（推荐的封闭缓冲液可在 1-2% 牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白或含或不含 0.2% 吐温 20 和叠氮化钠的 TBS (PBS) 中的脱脂奶粉之间变化。）
注意：除非另有说明，否则所有孵化都应在室温下进行，以防止干燥并防止荧光染料暴露在光线下。

5.5一抗孵育

5.5.1在 PBS 中稀释一抗，Triton。体积为：每个切片 50-100ul，每个盖玻片、腔室或孔（48 或 96 孔板）25-50ul。
5.5.2吸出封闭溶液，应用稀释的一抗。
5.5.3在 4°C 下轻轻摇动或摇动孵育过夜。
5.5.4在 PBS 和 0.1% Triton X-100 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

5.6二抗孵育

5.6.1在 PBS、0.1% Triton X-100 中稀释的荧光染料偶联二抗在室温下于黑暗中孵育 1-2 小时。（从这一点开始，载玻片需要在黑暗中保存。）
5.6.2在 PBS、0.1% Triton X-100 中冲洗。

5.7荧光检测

5.7.1安装盖玻片。
5.7.2立即使用荧光显微镜检查

图5：直接免疫荧光制备的人体皮肤组织切片

卡梅德生物是一家提供常规和定制 IHC 和 IF 服务的可靠公司，在 IHC 和 IF 染色方面拥有 10 多年经验的优秀科学家，经验丰富的专家团队做技术支持以解决各类 IHC 和 IF 技术问题，以确保服务的质量和速度

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