CRISPR技术有效的防止脱靶现象方法

基因编辑领域目前可以采用以下策略降低脱靶效应：开发并合理利用预测脱靶效应的有效工具；开发新的基因编辑系统；利用高质量参考基因组设计靶标；好的基因编辑工具递送系统。“上面几种技术策略的利用，可以有效减少或避免脱靶。

在此推荐一种非常成熟的关于CRISPR基因编辑防脱靶、高效编辑的一种方法

IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统

IDT（Integrated DNA Technologies）作为核酸定制合成领域的知名企业，依托30年来的技术研发，推出了Alt-R系列CRISPR-Cas9基因编辑产品，通过对gRNA序列、Cas9核酸酶优化，对RNP转染效率、同源重组修复HDR效率的提升，形成了从crRNA设计到CRISPR编辑结果检测的一站式解决方案，让CRISPR-Cas9系统更高效、更简单。

Alt-R CRISPR-Cas9概述

IDT的Alt-R CRISPR-Cas9系统，分别对crRNA、tracrRNA、sgRNA序列进行优化缩短、化学修饰，对化脓性链球菌S. pyogene Cas9内切酶结构域进行突变，获得了高精确性的单链、双链剪切功能，再通过电穿孔（如Lonza Nucleofector核转染系统）转染RNP，可进行精确地基因编辑操作。

传统构建CRISPR-Cas9质粒的方法，质粒大小高达6-10kb，很难转染，而如使用原代细胞等难转染的细胞，转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas9，使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法，通过优化CRISPR-Cas9组件，在提升剪切精确性的基础上，提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶，进而提高了基因编辑效率。

Alt-R CRISPR-Cas9实验流程

【方法一】

1、（使用IDT序列设计工具）设计Alt-R crRNA，使其间隔区（Spacer）序列与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成crRNA；

2、将Alt-R crRNA与Alt-R tracrRNA混合，通过crRNA的重复序列区（Repeats）与tracrRNA碱基配对, 形成向导RNA（guide RNA，简称gRNA）；

3、将gRNA与Alt-R Cas9蛋白混匀，形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，简称RNP)；

4、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；

5、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列（前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motif，简称PAM），对DNA进行剪切；

6、对DNA断裂处进行修复

①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining，简称NHEJ），实现基因敲除（knockout）；

②（使用IDT序列设计工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复（Homology directed repair，简称HDR），实现基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。

【方法二】

1、（用IDT工具）设计sgRNA，使其Spacer与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成sgRNA；

2、将sgRNA与Cas9蛋白混匀，形成RNP；

3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；

4、通过sgRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列，对DNA进行剪切；

5、对DNA断裂处进行修复

①进行非同源末端连接修复，实现基因敲除；

②（用IDT工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复，实现基因敲入、敲除、沉默等。

Alt-R crRNA序列设计示意图

Alt-R CRISPR-Cas9产品

1、Alt-R crRNA：由19-20nt特异性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解，必须与tracrRNA一起使用以形成gRNA。

2、Alt-R crRNA XT：相比Alt-R crRNA，经其他化学修饰，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验，可提高编辑的稳定性。必须与tracrRNA一起使用。

3、Alt-R sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合组成的单个RNA，含有19-20nt的特异性序列（定制）和80nt通用序列，经化学修饰，稳定性更高，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验。相比体外转录的sgRNA，减少细胞免疫反应，更小细胞毒性。

4、Alt-R tracrRNA：通用67nt序列，远远短于野生型的89nt，缩短后性能提高，经化学修饰，具有核酸酶抗性。可提供荧光标记，检测转染效率。必须与crRNA一起使用以形成gRNA。

图.稳定表达Cas9蛋白的HEK-293细胞，转染Alt-R crRNA(未标记):tracrRNA(标记)，转染后48小时，荧光显微镜下10倍放大。

5、Alt-R Cas9核酸酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His标签。Alt-R HiFi Cas9高保真核酸酶，经序列优化，提高中靶率，降低脱靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。

6、Alt-R Cas9切口酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。其中Alt-R Cas9 D10A切口酶中RuvC-like内切酶结构域功能失活，对DNA靶向链进行单链切割。Alt-R Cas9 H840A切口酶，HNH结构域失活，对非靶向链单链切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。

7、Alt-R dCas9蛋白：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，丧失内切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。dCas9蛋白可用于CRISPRi，进行基因下调（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在转录起始位点附近才能发挥功能，其脱靶率远低于RNAi。Alt-R dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。

8、Alt-R Cas9电穿孔Enhancer：是Cas9特异性的载体DNA，当使用原代细胞或难转染细胞时，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核转染系统等电穿孔设备对RNP的转染效率，进而提高基因编辑效率。

9、Alt-R HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。

10、Alt-R HDR供体寡核苷酸：专门为同源重组修复基因敲入开发，具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率，可同时用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。

Alt-R CRISPR-Cas9优势

1、特别优化的crRNA/tracrRNA/sgRNA长度，提高编辑性能

以HPRT基因中的12个位点为靶点，分别使用Alt-R crRNA:tracrRNA、Alt-R crRNA XT:tracrRNA、Alt-R sgRNA，与Alt-R Cas9核酸酶组装成3种RNP，加入2μM Alt-R Cas9电穿孔Enhancer，转染HEK-293细胞，培养48小时后，通过二代测序检测总的编辑效率，结果显示其具有很好的稳定性。

2、化学修饰RNA，增加核酸酶抗性，减少免疫应答和细胞毒性

以HPRT1的12个位点为靶点，分别用Alt-R crRNA:tracrRNA、体外转录（IVT）RNA，转染可高效表达化脓性链球菌Cas9蛋白的HEK-293细胞，24小时后，测定常见应激反应基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表达水平。（A）qPCR显示IVT RNA强烈诱导IFIT1，而Alt-R RNA无影响。（B）qPCR显示IVT RNA对OAS2的诱导可测，而Alt-R RNA处于基线。同时IFITM1、RIGI、OAS1等3个应激反应相关基因均得到相似结果，说明Alt-R RNA不会激活细胞先天免疫反应。

3、优化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特异性切割

4、电穿孔Enhancer，提高转染效率，尤其是原代细胞等较难转染的细胞

用0.125μM-4μM RNP（Alt-R crRNA:tracrRNA:Cas9复合体），通过Lonza Nucleofector 核转染K562细胞（A）、Jurkat细胞（B）、HEK-293细胞（C）时，使用电穿孔Enhancer（深蓝色）、不使用（浅蓝色）的编辑效率。

5、HDR Enhancer，提高同源重组修复效率

①提高多种细胞HDR

以人HPRT为靶点，使用Lonza Nucleofector核转染系统，将4μM RNP（由Alt-R crRNA、Alt-R tracrRNA、Alt-R Cas9组装），加入4μM Alt-R Cas9电穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作为同源重组修复DNA模板，转染人多种细胞系。电转后，细胞培养在含30μM Alt-R HDR Enhancer的培养基中（绿色），或培养在含有DMSO的培养基中作为阴性对照（棕色），HEK-293、HeLa培养48小时，Jurkat、K562培养72小时，通过限制性片段长度多态性（RFLP）、靶序列PCR进行HDR分析，显示Alt-R HDR Enhancer可提高多种细胞类型的同源重组修复效率。

②提高多种基因HDR

以人基因组多个位点为靶点，将4μM Alt-R Cas9 RNP，加入4μM Alt-R Cas9电穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer单链DNA模板，通过电穿孔转染。电转后，细胞分别培养在含30μM Alt-R HDR Enhancer的培养基（蓝色）、含有DMSO的培养基（绿色）、未处理的培养基（棕色），48-72小时后，通过RFLP、PCR进行HDR分析，显示Alt-R HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。

6、在线CRISPR序列设计工具，方便地设计高质量的crRNA/sgRNA/同源重组修复DNA模板/引物等

如物种的基因组富含A、T，或Alt-R CRISPR-Cas9的位点不适合，IDT同时提供CRISPR-Cas12a系统，尽可能满足编辑需求。

CRISPR技术有效的防止脱靶现象方法相关推荐

锅炉结垢不停炉不停工在线除垢技术与7种化学清洗水垢方法优势对比
锅炉结垢不停炉不停工在线除垢技术与7种化学清洗水垢方法优势对比一.锅炉结垢的原因锅炉结垢的原因是锅炉给水中含有钙镁硬度.腐蚀形成氧化铁.硅等含结垢成分物质,结垢成分物质在炉水中不断被加热浓缩.溶解 ...
中医的诊断技术是落后的，思想方法是片面的
http://bbs.news.163.com/bbs2009/article.jsp?boardid=tech06&articleid=93169&userid=-wPna &quo ...
获取预制体_基于弱磁探测技术的轴承滚动体转速检测方法研究
摘要针对高速轻载轴承保持架打滑测试中滚动体速度检测的难题,利用弱磁探测技术探测滚动体的弱磁场,并通过提取弱磁信号的特征频率实现滚动体转速的测量.搭建了测试平台进行试验,分析了测试距离与转速对滚动体弱 ...
生物群落数据分析最常用的统计方法：回归和混合效应模型、多元统计分析技术及结构方程等数量分析方法
原文>>>R语言生物群落数据统计分析应用 R 语言作的开源.自由.免费等特点使其广泛应用于生物群落数据统计分析.生物群落数据多样而复杂,涉及众多统计分析方法.本内容以生物群落数据分析 ...
CRISPR技术：基因编辑婴儿或能免受镰状细胞病和肌营养不良症困扰
全文共2490字,预计学习时长7分钟图源:cgtn CRISPR技术的出现,使得利用基因编辑治疗并预防疾病的前景变得可观.通过调整人类胚胎的基因,有可能使婴儿及后代摆脱某些遗传性疾病. 不过,国际科 ...
公开学术报告笔记 | 上海雷达同心学术论坛之雷达图像解译技术研讨会-合成孔径雷达学习成像方法初探
笔记原文链接:https://mp.weixin.qq.com/s/Cp5NhUhPZ91CmoeK-WytmQ ↑ \uparrow ↑ 打开上述链接即可阅读全文讲座信息: 报告人:武俊杰教授, ...
ppst开发技术视频——ubuntu crontab 的使用方法
ppst开发技术视频--ubuntu crontab 的使用方法:视频资源,请访问ppst 开发技术视频分享平台 , www.ppst.cc,上面有最新的技术视频,推荐大家把博客录制成视频吧,可以获取 ...
管道无损检测python_利用神经网络技术检测半透明材料缺陷的新方法
俄罗斯托木斯克理工大学开发了一种利用神经网络技术检测半透明材料缺陷的新方法,该方法比其他方法具有更高的测量精度.相关研究成果发表在最近的<无损评估>. 玻璃纤维是一种由多种成分组成的复合材 ...
基于矢量瓦片技术的Web电子海图优化方法
范梦琪, 宋伟东, 郑人维, 何欢. 2021. 基于矢量瓦片技术的Web电子海图优化方法[J]. 海洋科学, 45(2): 68-75. FAN Meng-qi, SONG Wei-dong, ZH ...

CRISPR技术有效的防止脱靶现象方法

CRISPR技术有效的防止脱靶现象方法相关推荐

最新文章

热门文章