kasp技术原理_基因型鉴定的多种方法

整理归纳一下我所知道的基因型鉴定方法，欢迎补充！(封面图片来自网络，侵删，位置：华中农园林院正门入口附近)

随着基因工程技术——CRISPR Case9的推广，特定突变体的获得相比从前容易了很多，但位点上的突变依然是随机的，如何从多个转化事件中高效、经济、准确筛选出目的基因型依然是一个困难，这里我分享目前所知的鉴定方法供大家参考。

1.二代测序 + IGV观察/call SNP软件分析

原理：设计多种标签序列(F向和R向)组合，使不同的组合对应不同的样本，根据测序输出的reads上的标签序列对测序结果中的样本进行区分，一次测序获得多个样本数据，且测序数据量不用太高，1-2G即可，最后根据测序结果与参考序列匹配情况和reads比例判断突变类型和纯合杂合情况；

优点：通量高，单个样本成本低，能够分辨单个位点存在的多种突变类型；

缺点：结果反馈速度慢，一般需要两周左右才能拿到结果，不适合小样本量的检测。二代测序结果比对后IGV观察，可以看到有位点一半的测序输出reads有3个碱基的缺少，是一个杂合突变。

2.一代测序 + DSDecodeM分析测序文件

原理：软件根据测序的信号峰双峰嵌套位置和强弱判断突变类型；

优点：速度快，一代测序结果一般第二天能得到，软件分析迅速；

缺点：单个样本成本高，不适合大样本量检测，位点存在两种以上的突变类型时，测序峰杂乱，手动和软件均不能很好的区分。一代测序输出峰图结果DSDecodeM分析结果(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)，可以看到分析结果为单个碱基的杂合突变。

3.KASP

原理：用不同的荧光标记不同的引物(两种引物末端有1个SNP变异)，PCR延伸后发出不同的荧光，根据荧光值判断基因型；

优点：检测速度快(扩增时间短)，通量高(qPCR仪一次可96板)；

缺点：试剂成本高，仪器设备较贵，只适用于检测单位点SNP变异，不能清晰的知道序列变异情况，适用范围较窄。KASP原理介绍图，使用各带一种荧光标记的引物，引物末端的碱基不一样，模板上为哪种碱基时相应的引物就合上去，延伸后发出相应的荧光(图片来自公开培训资料)。qPCR仪器输出荧光值图，A,B为纯合体荧光，H为杂合体荧光(图片来自公开培训资料)。

4.dCAPs

原理：在已知序列变异的情况下，利用突变形成的酶切位点对突变位点的PCR扩增产物进行进行酶切检测，根据酶切结果判断突变情况。

优点：成本低(单个样本仅需0.1ul酶即可)，通量大(可以同时对具有同类突变的大量样本进行检测)，周期短(PCR扩增加酶切后电泳1天可完成)；

缺点：需要已知突变位点的序列情况才可选择合适的内切酶，有的内切酶可能不常见。dCAPs酶切位点引物设计在线工具(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)，可以帮助你快速设计扩增引物和对应的合适可用的内切酶，理想情况下突变后直接形成酶切位点，但很多时候需要通过引物引入SNP变异才行，建议SNP数量不超过1个。dCAPs输出的酶切位点，内切酶选择识别6碱基以上回纹结构的，用于酶切的PCR产物序列中尽量只有1-2个该类酶切位点，避免条带太乱不好区分。dCAPs方法检测结果示例

5.SSR分析

原理：根据条带大小的不同分析基因型；

优点：检测速度快，通量高，能够检测最低1bp的长度差异(推荐3bp以上)；

缺点：试剂成本较高(使用专业分析仪)，只适合检测已知存在碱基缺失的突变位点。这是以前用大板胶进行电泳分析的图，现在多用专业的SSR分析仪进行，通量更高，实验安全性也更高(图片源自网络)

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