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做lncRNA/circRNA分子海绵研究，您需要了解这些技术：

1. Northern blot

2. RACE

3. FISH

4. RIP

5. RNA pull down

6. RAP/TRAP

7. 双荧光素酶检测

1． Northern blot（RNA印记技术）

技术应用：

1.定性及定量分析基因转录水平差异；

2.检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。

技术原理：

提取质量良好的RNA样品，并将其固定在硝酸纤维膜或尼龙膜等固相上，加入标记的核酸探针进行杂交。按照碱基互补配对原则，核酸探针会与固相上的RNA同源序列进行互补，加入显色系统即能显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量分析。

技术要点：

需要质量好的，且表达量高的RNA样品，可以先做QPCR检测。

2． RACE（cDNA 末端快速扩增技术）

技术应用：

获得lncRNA全长

RACE是一种基于PCR 从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，通过测序可获得目的mRNA的全长序列。

技术要点：

需要质量好的RNA，多挑克隆以获得最长最有可能的RNA片段。

3． FISH（荧光原位杂交）

使用特异性探针对RNA进行荧光标记，适用于mRNA/lncRNA/miRNA在细胞/组织中的表达定位检测。

技术应用：

1.用于组织/细胞miRNA/lncRNA/circRNA的表达定位检测；

2.用于组织/细胞lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA共定位检测；

3.用于细胞倍性检测。

技术要点：

探针特异性要好。

4． RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）

RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点，miRNA/lncRNA/circRNA的结合蛋白如AGO2等。

技术应用：

1.内源检测miRNA与靶基因3’UTR区的结合（miRNA-mRNA-AGO2）；

2.内源检测lncRNA/circRNA-miRNA-AGO2的结合。

技术要点：

准备5*10E7个以上细胞，保证细胞状态良好以最大化模拟正常生理状态下的RNA与蛋白间的相互作用。

5． RNA pull down(体外研究蛋白质与RNA互作)

使用体外转录法表及生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其它成分分离。复合物洗脱后，通过WB或MS检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

技术应用：

体外研究蛋白与RNA相互作用关系。

技术要点：

在实验之初，需先获得目的miRNA/lncRNA/circRNA（调取/合成），设计探针并进行生物素标记。

6． RAP/TRAP (RNA antisense Purification)

RAP方法是通过针对调控RNA设计互补生物素探针组，将RNA拉下来以后，与其共同作用的RNA或蛋白质（RBPs）就会同时被纯化获取，最后将提取的RNA做高通量测序或QPCR，从而得到与目标RNA互作的RNA类型；与此同时，RBPs可以开展western blot验证或者MS鉴定未知蛋白（RAP-MS）。

简单来说就是RAP是用circ/lncRNA的反向互补探针组去拉靶circ/lncRNA，再一起把结合在circ/lncRNA上的miRNA（和蛋白）拉下来，做测序或者qPCR。

如果lncRNA/此人从RNA的QPCR（△ct<12），表达太低，就要用TRAP。TRAP是包含了2个载体，一个是构建ncRNA-ms2融合RNA表达载体，另一个是GST-MS2蛋白融合表达载体。MS2蛋白结合ms2颈环序列，GSH磁珠拉下MS2-GST，再进行检测。

技术应用：

内源检测RNA与RNA，或RNA与蛋白相互作用关系。

技术要点：

需要质量好的，且本底表达量高的RNA样品，如本底表达量低，需要升级为TRAP检测。

7． Luciferase（双荧光素酶检测）

Luciferase是miRNA-靶基因研究中运用的最多的技术。

值得注意的是，对于lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA吸附的研究，做Luciferase实验的时候还需要考虑到以下因素：挑选的lncRNA和circRNA本身是否具备作为分子海绵的功能。

比如lncRNA表达于细胞核内而不在胞质，或者它们与AGO2蛋白没有结合（AGO2是lncRNA/circRNA发挥海绵作用的指示蛋白，分别与吸附的miRNA形成circRNA/lncRNA-miRNA-AGO2蛋白的三元复合物）。

所以在做双荧光素酶检测之前，你需要先做以下工作：

1.RIP-qPCR：检测lncRNA/circRNA是否与AGO2蛋白结合。

2.FISH：查看lncRNA/circRNA与miRNA的表达是否存在共定位。

风险提示：

由于双荧光素酶载体不能成环，所以做circRNA/miRNA检测时并不能完全模拟细胞内环境。

技术应用：

1.外源检测miRNA与靶基因RNA3’UTR的结合；（推荐）

2.外源检测miRNA与lncRNA/circRNA的结合。

3.通常用工具细胞HEK-293（植物系统除外）细胞进行，不需要目的细胞检测。

技术要点：

两个荧光素酶最好在同一个载体上，以做背景校正；靶向关系预测要精准；miRNA的mimics最好带荧光，以排除转染效率问题。

以上检测技术的适用性

总结成一张表：

如果每项检测结果均能指向同一阳性结合结论，

那么恭喜你，分子海绵研究成功！