9月14日-全外显子组测序分析流程

全外显子组测序分析及应用

Whole Exome Sequencing，WES

全外显子组测序分析及应用
- 一背景
- 二技术应用
  - 外显子捕获试剂盒有哪些？
  - 外显子捕获效率是什么？
  - 外显子测序一般建议做多少倍的覆盖？
  - 外显子测序能够测出多大的片段缺失？
  - 外显子捕获可以做CNV吗？
  - 外显子测序的优点是什么？
  - 外显子测序样品准备：

一背景

外显子(exon)是真核生物基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。全部外显子被称为“外显子组”(Exome)。
外显子组测序(Exome sequencing)是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
由于外显子组测序捕获目标区域只占人类基因组长度的约1% ，因此远比进行全基因组序列测序来得更简便、经济，目标区域覆盖度也更高，便于变异检测。

二技术应用

检测疾病样本中外显子区域内高风险碱基变异位点;
配合大样本分析，确定孟德尔遗传疾病相关外显子SNP位点和基因;
在癌症研究过程中，检测癌症样本外显子区域内的体细胞突变位点和潜在的融合基因
. 用于种群遗传学研究的大规模样本基因组分析，检测SNP位点、LD并绘制种群图谱。

外显子捕获试剂盒有哪些？

目前主要有Roche、Illumina和Agilent三家的外显子捕获试剂。Nimblegen和Illumina的捕获试剂盒中的探针是DNA探针，化学性质稳；Agilent的捕获试剂盒是RNA探针，有可能RNA不是很稳定。

外显子捕获效率是什么？

外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分，这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以，测到的序列中，有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。 Nimblegen大约是70%
Agilent大约是60%
Illumina大约是50%

外显子测序一般建议做多少倍的覆盖？

一般做100X或者150X。较高的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现小比例的突变。另外，外显子测序的覆盖不是很均匀，这样较高的平均覆盖率有利于保证大部分的区域有足够的覆盖倍数。

外显子测序能够测出多大的片段缺失？

大致能测出50bp的片段缺失。目前的测序主要还是用Hiseq 2000,单侧的测长就是100bp。由于外显子测序的覆盖很不平均，所以如果有大段的缺失，无法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。目前能够测到的，就是在一个read中发现的缺失。一个read的长度也就是100bp，所以大到50bp以下的片段缺失可以从外显子测序中测出来。

外显子捕获可以做CNV吗？

外显子测序因为有一个杂交捕获的过程，这样就会有一个杂交捕获效率的问题。各个外显子的杂交效率是不同的，其同源竞争的情况也不同，所以不同的外显子的覆盖率的差异就很大。所以一般情况下，外显子测序不能用于CNV的检测。但在癌症研究中，利用癌组织和癌旁组织对照，可以检测CNV。

外显子测序的优点是什么？

直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异；
外显子测序是全基因重测序的一个较为经济的替代手段，对研究基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等，一般在疾病研究中，会结合转录组测序一起研究；
人的全基因是3G，如果要把全基因都测一下，一般要平均30x的覆盖。也就是要90G的数据。这样的测序量，成本大约是一个样本6万多元。如果样本多的话，费用上可能负担不起。而外显子只占人全部基因序列的1%，而且是最关键的1%。把外显子全都测了，就相当于抓住了问题的主要矛盾。同时测序量大大降低。这就是用外显子测序来替代全基因重测序的第一个原因；
第二个原因是在做肿瘤测序的时候，肿瘤本身存在着较大异质性。肿瘤的基因序列是不稳定的，一直在变的，也就是肿瘤的深部、浅部可能其基因序是不一样的。为了测出各种突变，就需要有较深的测序重度，比如100x、甚至200x的测序深度。这时候外显子测序就可以做到高的测序覆盖度，同时费用不会太高。

外显子测序样品准备：

1） DNA样本：用TE缓冲液溶解，2 μg以上，260/280比值在1.8-2.0之间，浓度大于50 ng/μl。
2）细胞样本：收获培养的细胞后，去除培养液，立即置于液氮中快速冷冻。液氮冷冻半小时后，可以转移到-20°C或者-80°C冰箱中保存，运输时使用干冰包装。
3）新鲜冷冻组织：获取新鲜的组织样本后，立即置于液氮中快速冷冻。液氮冷冻半小时后，可以转移到-20°C或者-80°C冰箱保存，运输时使用干冰包装。
4）石蜡包埋组织：一片H&E染色的病理切片（标记出肿瘤组织区域，肿瘤细胞含量>50%）；5-10片4-5um厚的肿瘤组织石蜡切片（与染色的切片来自同一石蜡组织块，肿瘤组织与染色的切片相吻合）；病人的病理诊断报告（需至少标明肿瘤的类型）；可以在常温条件下运输（防止高温致蜡块融化）。
5）血液样本：1ml新鲜抽取的血液，加抗凝剂（非肝素类）， 4度保存（可维持一周），冰袋运输。
6）单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上。
7）肿瘤有效测序深度100X以上。