易基因 | DNA甲基化测序新技术发布：扩展重亚硫酸盐测序（XRBS）

DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。目前研究中常用的DNA甲基化测序方法包括全基因组（WGBS、oxWGBS等）、简化基因组（dRRBS、RRBS等）、靶向基因组（液相捕获）、靶向基因（扩增子）和850K芯片等，适用于多种不同应用场景。今天给大家介绍一种针对DNA甲基化测序的新方法——扩展重亚硫酸盐测序（XRBS），该方法文章2021年5月发表在Nature Biotechnology期刊上，赶紧先睹为快吧。

标题：Extended-representation bisulfite sequencing of gene regulatory elements in multiplexed samples and single cells.基于多重样品和单细胞中基因调控元件的扩展重亚硫酸盐测序

时间：2021-05-06

单位：美国哈佛大学麻省总医院

期刊：Nature Biotechnology

影响因子：IF 54.908/Q1

平台： XRBS（易基因可提供该技术服务）

样本：人

研究背景

在人类基因组中，90%以上的CpG位点是被甲基化的，CpG位点的分布有两种形式，一种是少量分散在基因组中，另一种就是集中在启动子周围高密度的CpG岛。DNA甲基化参与各种不同的基因调控过程，从而调控多种复杂的生物过程，如胚胎发育，衰老和肿瘤发生等，哺乳动物CpG甲基化有助于基因组的稳定性和转录调控。除启动子外，远端调控元件的DNA甲基化模式与细胞特性和染色质结构相关，特别是在增强子和CTCF结合位点，因此全面分析DNA甲基化对了解细胞状态和动态至关重要。

DNA甲基化的生物学作用已通过全基因组或简化基因组甲基化测序分析方法阐明，但这些方法不能有效地研究哺乳动物基因组中的大量非编码调控元件。全基因组甲基化测序（WGBS）是覆盖整个基因组范围，费用较高，效率相对较低。而简化甲基化测序（RRBS）主要针对CpG富集区域进行甲基化测序，缺乏CpG岛以外的增强子区域和CTCF结合位点的覆盖。因此研究人员提出了一种可以富集覆盖启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化测序方法——extended-representation bisulfite sequencing, XRBS，该方法可以在低样本量和单细胞中高效兼容。

研究设计

首先，研究人员通过甲基化不敏感酶MspI切割基因组序列成短片段，之后对这些基因组片段的连接序列上加上样品特异性条形码。
随后在亚硫酸盐转化前通过生物素富集方法去除多余的序列，捕获对应的DNA片段。
将经亚硫酸盐处理的DNA片段用随机六聚体进行扩增，并引入第二个接头序列，该方法可以大大增加DNA甲基化位点区域覆盖范围并有效恢复亚硫酸盐处理后的低质量降解DNA片段。
因六聚体引物序列不完全匹配基因组模板，因此将唯一的分子标识符（unique molecular identifier，UMI）来识别不同PCR文库的重复序列，随后获得的文库序列进行高通量测序。
比较 WGBS、RRBS、850K芯片与XRBS方法对DNA甲基化区域的研究结果。
进一步分析XRBS在不同细胞类型的低样本量的基因组样品中甲基化分布情况。
利用XRBS方法进行单细胞DNA甲基化测序分析。

图1

数据结果：

XRBS覆盖更广泛的基因调控元件，且具有更高的效率和更低的测序深度要求

研究人员系统地比较了CpG岛、基因启动子、增强子和CTCF结合位点等元件的覆盖率和富集情况。研究结果显示，在统一的测序条件下，XRBS覆盖83.5%的CpG岛区域(图2a)，RRBS为72.0%，因为WGBS不富集CpG区域，所以WGBS覆盖的比例较低(17.8%)，如果WGBS需要对CpG区域覆盖类似的程度，则需要5.3倍的测序深度。在所有启动子区域，无论CpG密度如何，XRBS、RRBS和WGBS的覆盖率分别为81.7%、67.7%和40.3%(图2b)，如果用WGBS获得类似的覆盖率则需要比XRBS多2.4倍的测序深度。

当测序深度饱和（约180亿碱基对时）时，XRBS共覆盖了25025个CpG岛(90.2%)和22684个基因启动子(86.1%)。在增强子（H3K27ac）和CTCF结合位点的覆盖层面，XRBS包含了38211个H3K27ac峰值和18059个CTCF结合位点，RRBS对应的数值为15239个和5170个（图2c）。在测序深度为100亿碱基对时，对于H3K27ac和CTCF结合位点，使用WGBS进行类似的测序需要的深度分别是XRBS的1.6倍和2.7倍。

对CTCF结合位点周围的DNA甲基化覆盖情况进行可视化分析（图2e），发现10ng XRBS甲基化谱具有明显更高的覆盖率。以上结果表明，XRBS覆盖更广泛的调控元件，且具有更高的效率和更低的测序深度要求。

图2

2. XRBS可检测不同细胞类型的DNA甲基化差异

研究团队使用XRBS对来源于不同细胞类型的低样品量（100-1000个细胞）基因组样品甲基化模式进行比较分析。纳入4种细胞类型：K562细胞和三个白血病细胞（Kasumi-1、OCI-AML3和HL-60）。使用低覆盖率测序数据，研究人员发现K562细胞整体甲基化水平较低（beta平均值=0.28）；Kasumi-1细胞整体高甲基化状态（beta平均值=0.72）；而OCI-AML3和HL-60处于中间化甲基化水平（beta平均值=0.62和0.60）（图3a）。这些整体DNA甲基化平均值的差异主要体现在非CpG岛的CpG，因为大多数CpG岛在细胞系中仍保持相对低甲基化（图3b）。与公共数据库中ChIP-seq和Hi-C测序数据的进一步交叉验证分析，均证实了XRBS测序甲基化位点分布的准确性（图3c,d,e,f，g）。

图3

3. XRBS可预测功能元件的状态

研究人员对上述四种细胞类型的1000个细胞文库进行深度测序分析。分析结果表明，在单个细胞中特异性高甲基化的1473个启动子中，Kasumi-1中检测到最多（62.0%），与其整体高DNA甲基化水平保持一致（图4a）。与此同时，在单个细胞中特异性低甲基化的2499个启动子中，绝大多数在K562细胞中检测到（92.4%），进一步分析比较这些结果与可用的基因表达数据一致。此外，研究发现XRBS甲基化分析是预测增强子活性（图4b）及CTCF结合位点相关研究（图4c）的有效方法。

图4

4. XRBS 可应用于单细胞DNA甲基化研究

XRBS具有支持多路复用的关键特性，例如前期条形码和混合亚硫酸盐转化非常适用于单细胞分析，条形码的加入使得XRBS能够对单细胞文库进行混合测序并有效鉴定相应单细胞的DNA甲基化分布情况。使用XRBS方法进行高通量测序，一共获得了高达187万个独特的reads和343万个CpG位点（图5a,b）。

来自两个物种的基因组的比对确认条形码交叉污染极为罕见（图5c），此外，基于纯合单核苷酸多态性 (SNP) 的细胞可以区分 K562 和 GM12878，为最小交叉污染提供进一步的证据（图5d）。本实验产生了高质量的测序数据：27个K562细胞、32个GM12878 细胞和31 个Yac1细胞，保证了后续数据分析的准确性，也充分展示了XRBS在单细胞DNA甲基化分析中的应用潜力。

图5

易基因小结

研究目的：

基于多重样品和单细胞中DNA甲基化靶向测序技术的开发及应用

研究结果：

XRBS覆盖更广泛的基因调控元件，且具有更高的效率和更低的测序深度要求
XRBS可检测不同细胞类型的DNA甲基化差异
XRBS可预测功能元件的调节状态
XRBS 可应用于单细胞DNA甲基化研究

易基因点评：

XRBS通过早期条形码这一步骤实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于低起始量样本和单个细胞。XRBS丰富了已被证明与CpG甲基化功能相关的区域：启动子、CpG岛、增强子、CTCF 结合位点，在效率、覆盖范围和灵敏度方面比现有传统的甲基化测序方法具有明显优势。另外，单细胞XRBS测序分析数据的应用将DNA甲基化和细胞异质性联系起来，并将表观遗传变化与遗传特征（包括 CNV 和 SNP）协调起来，在未来疾病甲基化研究中具有广阔的应用空间，特别是在低起始量多维度分析中。

文献来源：

S. J. Shareef, S. M. Bevill, A. T. Raman, M. J. Aryee, P. van Galen, V. Hovestadt, et al., "Extended-representation bisulfite sequencing of gene regulatory elements in multiplexed samples and single cells," Nature Biotechnology, May 6 2021.

原文解读：

易基因 | DNA甲基化测序新技术发布：扩展重亚硫酸盐测序（XRBS）https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwNTY3NDIxMw==&mid=2650648826&idx=1&sn=ebf8acbcfb52bc79b15cba7929a6671a&chksm=83101570b4679c665e56a3e4598de919230785fae1b7c7cd46e6f951b92222dcb17521e803a0&token=1244460761&lang=zh_CN#rd直播预告 | 染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）应用实例分析（表观调控和转录调控）https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwNTY3NDIxMw==&mid=2650648806&idx=1&sn=0343904fe61ae9ba87d05f1ac3b70ffd&chksm=8310156cb4679c7ae56eeec0c9c0df5b998071bb4b2a6f7c6fd8069712986540af063f985ce2&token=1244460761&lang=zh_CN#rd

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