易基因｜综合DNA甲基化测序揭示前列腺癌死亡率的预后表观遗传生物标志物

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2022年09月30日，《Clin Transl Med 》杂志发表了题为“Comprehensive methylome sequencing reveals prognostic epigenetic biomarkers for prostate cancer mortality”的研究文章，通过全基因组DNA甲基化测序技术（WGBS）综合分析，从表观遗传学角度揭示了前列腺癌死亡率的预后表观遗传生物标志物CACNA2D4。

标题：Comprehensive methylome sequencing reveals prognostic epigenetic biomarkers for prostate cancer mortality（综合DNA甲基化测序揭示前列腺癌死亡率的预后表观遗传生物标志物）

发表期刊：Clinical and Translational Medicine

发表日期：2022年09月30日

影响因子：8.554/1区

方法：WGBS、目标基因多重亚硫酸盐PCR测序验证

图形摘要

研究摘要：

背景：

前列腺癌是一种临床异质性疾病，部分患者会迅速发展为致命的转移性前列腺癌。目前的临床病理学指标并不能完全预测疾病进展，表观遗传变化是肿瘤发生过程中最早的分子变化之一。为寻找新的预后生物标记物以实现早期干预和改善预后，作者对局限性前列腺癌患者的DNA甲基化进行测序分析，并进行长期临床随访。

方法：

利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）全面绘制并比较致死组（n=7）和非致死组（n=8）前列腺癌患者（中位随访19.5年）根治性前列腺切除术（RP）后组织的DNA甲基化图谱。在独立队列中（n=185，中位随访15年），使用目标区域的靶向多重亚硫酸盐测序对差异甲基化区域（DMR）进行验证。通过单变量和多变量分析评估生存率，包括临床病理学指标（log-rank和Cox回归模型）。

结果：

WGBS数据分析证明了癌症的特异性甲基化模式：CpG岛高甲基化和重复元件的低甲基化，增加了疾病风险。作者鉴定了1420个DMR与前列腺癌特异性死亡率（prostate cancer-specific mortality，PCSM）相关，表明前列腺癌中下调基因组和癌症中的de novo甲基化基因组富集。将DNA甲基化测序数据与前列腺癌公共数据集比较后，作者改进DMR建立了一个包括18个基因的预后panel。将这个panel设置成独立队列，发现PCSM与EPHB3、PARP6、TBX1、MARCH6、CACNA2D4内调控元件的高甲基化之间存在显著关联。值得注意的是，与单纯的肿瘤分级相比，在多变量模型中包含CACNA2D4甲基化是更好的PCSM预测因子(Harrell’s C-index:0.779 vs. 0.684)。

结论：

本研究绘制了全面的非致死组和致死组前列腺癌的整体甲基化水平图谱，并鉴定了区分这些患者群体的新基因区域（novel genic regions）。将鉴定的DNA甲基化生物标记物与现有临床病理学指标结合，可以改善前列腺癌死亡率的预后模型，有望在临床应用。

研究思路：

队列研究

发现队列由15名接受了RP治疗的临床局限性前列腺癌患者组成，RP后10年内有7名患者死于前列腺癌（致死组n=7），其余8例患者在最后一次随访时还活着（最低：13.5年，中位数：19.5年）（非致死组n=8）。根据肿瘤分级、临床分期和局部浸润（精囊浸润和包膜外）将非致死组与致死组进行匹配。对照组来自四名前列腺癌患者的相邻正常组织（癌旁组织）。

验证队列是由186名前列腺癌患者组成的独立小组，用于验证在发现队列中鉴定的18个DMR的预后意义。随访期间（中位数：15年，范围：0.8-22年），86名患者BCR（生化复发），25名患者MR（转移性复发），16名患者因前列腺癌死亡。

WGBS

采集来自两个队列RP标本的FFPE前列腺肿瘤组织。从组织学验证的肿瘤区域（至少50%的肿瘤细胞（通常>70%））中采集五个1 mm肿瘤组织用于基因组DNA提取。从4位患者的0%肿瘤细胞（非癌，前列腺导管内癌，前列腺上皮内瘤变，增生性炎性萎缩或坏死）区域中采集五个1 mm组织用于对照组。提取DNA定量并储存在-80℃直至用于WGBS测序分析。

结果图形

（1）原发性前列腺癌的WGBS甲基化分析揭示了非致死组和致死组患者之间的整体和位点特异性甲基化差异

图1：发现队列研究结果。

（A）致死组（红色）和非致死组（绿色）疾病患者以及正常邻近组织（浅棕色）患者癌组织中全基因组DNA甲基化变异的主成分（PCA）分析。

（B）（i）CpG岛，（ii）CpG岛岸，（iii）LINE-1重复元件和（iv）长串联重复序列（LTR）。点表示每个患者的甲基化中值。

（C）所有1420个差异甲基化区域（DMR）热图（高甲基化-深绿色；低甲基化-紫色），正常相邻组织（棕色）、非致死性（绿色）和致死性（红色）、淋巴结癌前列腺（LNCaP）（紫色）、前列腺上皮细胞（PrEC）（蓝色）前列腺癌细胞系样品甲基化水平。

（D）代表性DMR（DEUP1-DMR＃9，绿松石条）的DMR热图，非致死组（绿色）与致死组（红色）中患者甲基化。DEUP1基因-深蓝色条，启动子CpG岛-深绿色条。

（E）不同基因组特征的DMR交集百分比条形图。左：CpG岛（深棕色），CpG岛岸（浅棕色）和非CpG岛（棕色）。右：启动子（深紫色），基因体（gene body）（浅紫色）和基因间区域（紫色）。

（F） PrEC和LNCaP ChromHMM状态与所有高甲基化DMR之间重叠百分比差异条形图。ChromHMM分割数据中推测调控元件分为启动子（活性转录起始位点TSS、侧翼活性TSS）（绿色），转录（5'转录、3'转录、强转录、弱转录）（浅绿色），增强子（基因增强子，增强子）（深绿色），bivalent（bivalent /平衡TSS，侧翼bivalent TSS，bivalent增强子）（浅橙色），抑制（ZNF基因和重复，异染色质，抑制polycomb，弱抑制polycomb）（红色）和静态（浅灰色）。

（G） MSigDB 数据库（Molecular Signatures Database）C2集合的高甲基化DMR富集的前10个基因集。q值表示富集意义，黄色突出指癌症相关基因集。

（2）预后DNA甲基化基因组区域的选择标准

表2：选择18个差异甲基化区域（DMR）作为预后生物标志物进行验证

（3）生存分析

图2：Kaplan–Meier生存曲线：临床病理因素

四种临床病理因素的Kaplan-Meier生存分析：ISUP分级组（A，E，I），病理T分类（B，F，J），术前前列腺特异性抗原（PSA）水平（C，G，K）和三个终点——生化复发（A-D）、转移复发（E-H）、前列腺癌特异性死亡率（I-L）的边缘状态（D，H，L）。

图3：单变量生存分析

（A）单变量Cox回归分析：单变量Cox回归分析中显著的甲基化单变量风险比、95% CI（confidence interval）、p值和临床病理变量森林图：（i）生化复发、（ii）转移性复发和（iii）前列腺癌特异性死亡率。甲基化区域-橙色阴影，临床病理因素-棕色阴影。（B） CACNA2D4（DMR#10）预后潜力：Kaplan-Meier生存曲线，终点为：（i）生化复发，（ii）转移性复发和（iii）前列腺癌特异性死亡率。红线表示高甲基化（>75%），蓝线表示低甲基化 (≤75%）。

表3：验证队列中的多变量Cox回归分析结果（n=185），使用SES（Statistically Equivalent Signatures）特征选择算法，包含（i）或不包含（ii）甲基化测量作为input变量选择的最大预测能力模型

研究结论：

本研究发现为验证新的表观遗传生物标记的更大前瞻性随机研究提供了强有力基础，包括CACNA2D4位点的潜在预测价值。未来的机制研究将鉴定这些表观遗传生物标记物是否能够识别导致前列腺癌转移和死亡的关键调控通路的早期失调。

关于全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS)

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

全基因组甲基化图谱课题
标志物筛选课题
小规模研究课题

技术优势：

应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

参考文献：Pidsley R, Lam D, Qu W, Peters TJ, Luu PL, Korbie D, Stirzaker C, Daly RJ, Stricker P, Kench JG, Horvath LG, Clark SJ. Comprehensive methylome sequencing reveals prognostic epigenetic biomarkers for prostate cancer mortality. Clin Transl Med. 2022 Oct;12(10):e1030.

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