易基因｜病毒抗性：全基因组DNA甲基化揭示草鱼年龄相关病毒易感性的表观遗传机制
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2022年06月02日，淡水生态与生物技术国家重点实验室（中国科学院水生生物研究所）何利波副研究员为第一作者和通讯作者，汪亚平研究员为共同通讯作者在《Immun Ageing》杂志发表了题为“Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp”的研究论文，该研究通过全基因组DNA甲基化测序（WGBS）和对应的转录组测序（RNA-seq），并通过BSP和qPCR验证，揭示了草鱼年龄依赖病毒易感性的潜在表观遗传机制。
标题：Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp（全基因组DNA甲基化揭示了草鱼年龄相关病毒易感性的潜在表观遗传机制）
时间：2022.06.02
期刊：Immunity & Ageing
影响因子：IF 9.701
技术平台：WGBS、RNA-seq、BSP、qPCR
样本实验：
选取未进行病毒攻击实验的草鱼，性别比例1：1，取其脾脏组织样本进行WGBS和RNA-seq测序分析。分为FMO组和TYO组，每组三个重复，共六个文库（每个文库n=5）。
研究思路：
背景意义：
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是中国重要的养殖鱼类，受到多种病原体，尤其是草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的感染。值得注意的是，草鱼对 GCRV 的敏感性与年龄有关，也就是说，一年以下的草鱼对GCRV敏感，而三年以上的草鱼对这种病毒有抗性。然而，潜在的机制仍不清楚。
本研究以5月龄感病草鱼(five-month-old,FMO)和3年龄抗病草鱼(three-year-old,TYO)为研究对象，对其全基因组DNA甲基化和基因表达变化进行了研究，旨在揭示潜在的表观遗传机制。
结果：
比色法定量检测结果显示，TYO组整体甲基化水平高于FMO组。TYO组和FMO组的全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析，结果发现6214个差异甲基化区域（DMR）和4052个差异甲基化基因（DMG），其中大部分DMR和DMG在TYO组中表现出高甲基化模式。相关分析表明，启动子区域的DNA低甲基化和基因体（gene body）区域的DNA高甲基化与基因表达有关。富集分析表明，TYO组中的启动子区hypo-DMG在免疫反应通路中显著富集，而TYO组基因体区hyper-DMG在RNA转录、生物合成和能量产生方面显著富集。对应的RNA-seq分析表明，大部分基因在TYO组中上调。此外，基因功能分析显示，参与能量代谢的两个基因表现出抗病毒作用。
结论
本研究利用WGBS和RNA-seq技术，揭示了不同年龄草鱼 DNA 甲基化的全基因组变化。与免疫应答、生物合成和能量代谢相关的基因的 DNA 甲基化和基因表达的变化可能导致草鱼对GCRV的年龄依赖易感性。该研究结果为草鱼的抗病育种计划提供了重要信息，也可能有利于对人类年龄依赖性疾病的研究。
相关图形
（1）整体甲基化概况和全基因组重亚硫酸盐测序
图1：两组对草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的年龄依赖性易感性和整体甲基化概况
- 两组草鱼感染GCRV后的总死亡率。
- 两个草鱼群体整体DNA甲基化水平。
- CG、CHG和CHH中甲基胞嘧啶的百分比。
- mCG、mCHG和mCHH位点附近序列的Logo图。
- 两组间DNA甲基化水平分布。
表1：WGBS数据
（2）基因甲基化图谱分析
图2：平均甲基化胞嘧啶（mC）在不同基因组区域分布以及两组鉴定的差异甲基化区域（DMR）。
- 基因体区域及其上下游区域的相对甲基化水平。
- 不同基因元件的相对甲基化水平。
- DMR热图。
- DMRs在基因组中的分布。
（3）DNA甲基化与基因表达的相关性研究
表2：RNA-seq数据
图3：不同基因的DNA甲基化和mRNA表达。
- 5月龄感病组不同基因分组(具有不同的mRNA表达水平)的甲基化水平。
- 5月龄感病组启动子区域不同基因分组(具有不同的甲基化水平)的mRNA表达水平。
- 5月龄感病组基因体区域不同基因分组(具有不同的甲基化水平)的mRNA表达水平。
- 启动子区下调DMGs的DNA甲基化与基因表达的相关性。
- 基因体区域上调DMGs的DNA甲基化与基因表达的相关性。
（4）DMG的功能富集分析
表3：启动子区hypo-DMG和基因体区hyper-DMG的GO富集分析（TOP 10）
图4：不同DMG的富集分析和不同基因的mRNA表达谱
- 启动子区域hypo - DMGs的KEGG富集分析。
- 基因体区域hyper - DMGs的KEGG富集分析。
- 参与免疫反应的基因的散点图。
- 参与蛋白质合成的基因的散点图。
- 参与能量代谢的基因的散点图。
（5）BSP和 qPCR 对WGBS数据验证
图5：通过BS-PCR和qPCR验证WGBS数据
- stat1b基因启动子区的DNA甲基化和基因表达谱。
- trap1基因启动子区的DNA甲基化和基因表达谱。
- gapdh基因的基因体区DNA甲基化和基因表达谱。
- ldha基因的基因体区DNA甲基化和基因表达谱。
（6）代谢相关基因的抗病毒作用
图6：两个代谢相关基因的抗病毒作用。
- Western blotting证实了两个基因在转染细胞中的过表达。
- 不同质粒转染细胞中编码GCRV非结构蛋白NS80和结构蛋白VP5基因的表达量。
- RT-qPCR证实siRNA敲低gapdhs。
- 不同siRNA转染细胞中编码NS80和VP5基因的表达量。
- RT - qPCR验证了siRNA对ldha的敲减。
- 不同siRNA转染细胞中编码NS80和VP5基因的表达量。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。
参考文献：
He L, Liang X, Wang Q, Yang C, Li Y, Liao L, Zhu Z, Wang Y. Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp. Immun Ageing. 2022 Jun 2;19(1):28.
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