【Front Plant Sci】LvMYB5 和 LvMYB1转录因子调控百合花青素合成
文章信息
题目：Regulation of MYB Transcription Factors of Anthocyanin Synthesis in Lily Flowers
刊名：Frontiers in Plant Science
作者：Xiaojuan Yin, Yulong Feng et al.
单位：Shenyang Agricultural University
日期：01 December 2021
01
摘要
花色是影响观赏花卉商业价值的决定性因素。因此，研究百合花色形成的调控机制，发现调控这一重要性状的因素具有重要意义。本研究对 MYB 转录因子 (TFs) 进行了表征，以了解百合花青素生物合成的调控机制。发现两个 R2R3-MYB 转录因子 LvMYB5 和 LvMYB1 可调节百合花中的花青素生物合成。具有激活基序的 LvMYB5 属于拟南芥SG6 MYB 蛋白亚群。LvMYB5的瞬时表达表明 LvMYB5 可以促进本氏烟叶片的着色，而LvMYB5的表达可以增加NbCHS、NbDFR和NbANS的表达水平。在百合花瓣中进行的 VIGS 实验表明，当LvMYB5沉默时，花青素的积累会减少。萤光素酶测定表明 LvMYB5 可通过激活ANS促进花青素合成基因启动子。因此，LvMYB5在百合花色中起着重要作用。此外，瞬时表达实验提供了 LvMYB1（一种 R2R3-MYB TF）抑制百合花中花青素合成的初步证据。百合花色苷生物合成相关激活和抑制因子的发现，为通过基因工程改善花色提供了理论依据。我们的研究结果为进一步研究百合花色形成机制提供了新的方向。
02
技术路线
03
主要结果
3.1 花青素积累与百合花瓣中的基因表达有关
为了测量百合花瓣发育过程中的颜色变化，我们测量了花蕾期（S1）、着色期（S2）和盛花期（S3）花瓣中的花青素含量。S1阶段的花瓣是无色的。S2期花瓣部分着色，S3期花全开，花瓣完全着色。在三个阶段的每一个阶段都从花瓣中提取总花青素。结果表明，与其他两个样品相比，S1 花瓣的花青素含量极低（图 1A、B）。S2期花瓣花青素积累明显，S3期花瓣花青素含量最高（图1A、B）。因此，花青素及其成分在百合花发育过程中逐渐积累。
为了分析与百合花色相关的基因，分离并克隆了两个调控基因LvMYB1和LvMYB5 。qRT-PCR 分析用于量化花发育过程中的基因表达。我们发现，在S2和S3阶段，LvMYB5的表达上调（图1C），这与花青素积累的趋势相似（图1B）。LvMYB1的表达在 S1 阶段最高，在 S2 和 S3 阶段显着下调（图 1D）。因此，LvMYB5和LvMYB1在花瓣颜色发展过程中表现出对比鲜明的表达模式。这些结果表明，两种 MYB TFs 都在花青素积累过程中表达，但它们的表达模式非常不同。因此，它们可能对花青素合成和/或积累产生相反的影响。
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3.2 转录因子LvMYB5和LvMYB1的功能分析
为了探索百合花瓣色素沉着过程中的基因表达，我们克隆了LvMYB5和LvMYB1基因。全长 cDNA 的长度分别为 720 和 630 bp。两种 cDNA 都包含一个完整的开放阅读框。亚细胞定位实验表明，LvMYB1和LvMYB5蛋白定位于细胞核，为核蛋白（图2）。
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我们接下来对来自LvMYB1、LvMYB5和来自拟南芥的 MYB 基因家族蛋白的预测蛋白质序列进行了系统发育分析（图 3A）。系统发育树显示 LvMYB5 是来自拟南芥MYB TF SG6 亚群的包含 AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113 和 AtMYB114 的进化枝的成员。因此，LvMYB5 可能与这些作为植物着色激活剂的蛋白质具有相似的功能。此外，LvMYB1 与拟南芥SG4 亚群中的 AtMYB3、AtMYB7 和 AtMYB32 分组。MYB 家族 TFs 和 LvMYB1 在抑制花青素合成方面可能具有相似的功能。因此，我们初步证实 LvMYB5 和 LvMYB1 在进化上与其他调节花青素生物合成的 MYB 转录因子密切相关。
使用 LvMYB5 和 LvMYB1 的蛋白质序列与来自其他植物的花青素合成相关的 MYB TF 构建多序列比对（图 3B）。发现 LvMYB5 类似于来自许多植物的激活剂型 MYB TF，例如 MaAN2、SIMYB75、AtMYB75 和 MdMYB1，它们包含共同的保守 R2/R3 结构域和激活基序。此外，与 bHLH 蛋白相互作用的 R3 结构域中 [D/E]Lx2[K/R]x3Lx6Lx3R 基序中的六个必需氨基酸也是保守的。因此，LvMYB5 可作为激活剂 MYB TF 促进百合花中花青素的生物合成。
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3.3 LvMYB5和LvMYB1分别促进和抑制本氏烟草叶片中花青素的积累
在瞬时表达实验中验证了LvMYB5和LvMYB1在花青素生物合成中的功能。将 35S：pGreenII（空载体）、35S：LvMYB5和 35S：LvMYB1 + 35S：LvMYB5构建体农杆菌浸润到本氏烟草的叶子中。我们发现空载体阴性对照不促进叶片的着色。然而，在被 35S: LvMYB5浸润的叶表皮细胞中，花青素显着积累（图 4A）。此外，本氏烟草中没有明显的花青素积累。叶与 35S：LvMYB1 + 35S：LvMYB5（图 4A）和 35S：LvMYB1共浸润，结构基因的相对表达降低（补充图 2）。因此，我们的研究结果表明LvMYB1和LvMYB5对百合花瓣着色具有相反的影响。LvMYB5促进着色，而LvMYB1抑制花青素积累。
从浸润的本氏烟草叶片中提取花青素，发现阴性对照叶片中不存在明显的色素。用 35S：LvMYB1和 35S ：LvMYB5构建体浸润的本氏烟草叶片含有非常少的花青素（图 4B）。花青素浓度测定结果还表明，35S :LvMYB5 浸润的叶片总花青素含量较高，而35S : LvMYB1和35S :LvMYB5浸润叶片的总花青素含量显着降低。（图4C）。
我们通过 qRT-PCR 进一步验证了本氏烟草叶片中的基因表达（图 4D）。我们发现，当 LvMYB5 过表达或与LvMYB1载体一起过表达时， LvMYB5的表达没有显着差异。这表明LvMYB1不抑制LvMYB5的表达。对本氏烟叶片结构基因表达水平的分析表明，与阴性对照相比，LvMYB5的瞬时过表达导致NbCHS 、NbDFR和NbANS的表达不同程度地上调。当LvMYB5和LvMYB1同时过表达，本氏烟中NbCHS、NbDFR和NbANS的表达下调。因此，LvMYB5是花青素生物合成的激活剂。相反，LvMYB1可能会抑制花青素生物合成途径中基因的表达。
3.4 LvMYB5和LvMYB1分别促进和抑制百合花瓣中花青素的积累
进行瞬时过表达实验以研究LvMYB1和LvMYB5对百合花瓣着色的作用。含有 35S：pGreenII（空载体）、35S：LvMYB5 和 35S：LvMYB1 的农杆菌培养物用于侵染百合芽的外花瓣，这些花瓣是绿色的，刚刚开始着色（补充图 3）。一周后，我们发现被空载体培养物浸润的花瓣由于受到细菌感染的影响而略有变色。然而，与空载体对照花瓣相比，过度表达 35S :LvMYB5的百合花瓣颜色更深（图 5A), 并具有较高的花青素水平 (图 5B,C )。此外，过表达35S :LvMYB1的百合花瓣出现明显的褪色（图5A），花青素积累也明显减少（图5B、C）。这些结果进一步表明LvMYB5可以促进花青素积累，而LvMYB1可以抑制花青素积累。
3.5 沉默LvMYB5基因会抑制百合花瓣中的花青素合成
为了进一步分析LvMYB5激活剂在百合花瓣花青素生物合成中的作用，将LvMYB5基因的330 bp DNA片段克隆到pTRV2载体中进行VIGS（病毒诱导基因沉默）。结果表明，感染空TRV载体的百合花瓣颜色无明显影响，而感染pTRV2 -LvMYB5载体的百合花瓣颜色在感染后变白。LvMYB5基因被沉默（图6A）。花青素提取和定量表明，在感染了 pTRV2 -LvMYB5的花瓣区域中，花青素的量显着降低（图 6B，C）。对感染pTRV1和pTRV2 -LvMYB5载体的百合花瓣基因表达水平分析表明，与阴性对照相比，其引起LvMYB5、LvCHS、LvDFR和LvANS表达不同程度的下调，而LvMYB1的表达没有受到显着影响（图 6D）。当LvMYB5被沉默时，百合花瓣中花青素的积累严重减少。因此，LvMYB5的沉默可以通过下调花青素生物合成途径中结构基因的表达来影响百合花瓣的色素沉着。我们得出结论，LvMYB5在百合花瓣着色中具有重要作用。
3.6 LvMYB5转录因子与花青素合酶启动子的结合
通过分析 1500 bp 百合ANS基因启动子（ANSp） 序列中的顺式作用元件，我们发现在 ANS 基因启动子区域存在多个 MYB 结合位点（图 7C）。为了研究 ANSp 中的主要 MYB 结合位点，我们构建了 ANSp DNA 片段被截短的表达载体。基于MYB结合位点分析，我们构建了三个含有截短ANS启动子片段的载体：ANSp1、ANSp2和ANSp3 DNA片段的长度分别为1,200、900和300 bp（图7C）。用截短的 ANSp 片段进行的激活实验表明 pGreenII 62-SK + ANSp2-Luc 和 35S 之间的活性没有显着差异：LvMYB5+ ANSp2-Luc 治疗。类似地，35S：LvMYB5 + ANSp3-Luc 和 pGreenII 62-SK + ANSp3-Luc 处理之间没有显着差异（图 7D）。因此，ANSp2 和 ANSp3 中的 MYB 结合位点在 LvMYB5 激活 ANS 基因启动子中不起主要作用。然而，荧光素酶活性在 35S：LvMYB5 + ANSp1-Luc 和 35S：LvMYB5之间也没有显着差异+ ANSp-Luc ，两者都远高于其他任何处理。这些结果表明ANSp的–1,200至–900 bp区域的MYB结合位点可能是LvMYB5的主要结合位点；LvMYB5可以增加启动子的活性，诱导基因表达，进而促进花瓣组织中花青素的合成。此外，该区域的MYB TFs可以识别三个结合位点；两个 MYB 结合位点在 –1,061 bp 处部分重叠（在图 7C中以红色显示），这可能会增强它们的效果。因此，这些很可能是结合 LvMYB5 以激活ANS基因转录的主要顺式作用元件。
04
结论
在本研究中，编码 MYB TF 的与百合花颜色形成有关的基因LvMYB1和LvMYB5 被克隆，并对其功能进行了表征。这些基因编码的蛋白质的功能通过瞬时过表达、病毒诱导的基因沉默 (VIGS)、双荧光素酶测定和亚细胞定位来验证。在本研究中，我们分析了两种不同 MYB 基因在百合花色素沉着中的调控作用，以揭示在百合花颜色形成中起作用的分子调控机制。这将使我们更好地了解百合和其他观赏植物花色的发育和调控。
05
获取原文
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.761668/full
END
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