【Front. Plant Sci.】来自辣椒的CaALAD基因可以赋予转基因拟南芥耐寒性

文章信息

题目：The CaALAD Gene From Pepper (Capsicum annuum L.) Confers Chilling Stress Tolerance in Transgenic Arabidopsis Plants

刊名：Frontiers in Plant Science

作者：Huiping Wang, Guobin Zhang et al.

单位：Gansu Agriculture University

Date: 29 April 2022

摘要

ALAD基因编码一种对叶绿素生物合成至关重要的酶，并参与植物的许多其他生理过程。本研究从辣椒中克隆出CaALAD基因并测序。来自九种植物的ALAD蛋白的多序列比对和系统发育分析表明，ALAD高度保守，CaALAD与茄子的ALAD蛋白同源性最高。亚细胞定位表明CaALAD蛋白主要定位于叶绿体。将CaALAD转化整合到拟南芥基因组后，转基因株系的耐寒性得到显著改善。低温（4°C）胁迫下过表达CaALAD的拟南芥植物中AtCBF2、AtICE1和AtCOR15b基因的转录增加，并且由于超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性增加，活性氧的含量降低。该研究初步表征了CaALAD的功能，将为今后辣椒耐寒性分子育种提供理论依据。

技术路线

主要结果

3.1 CaALAD序列和系统发育分析

来自多序列比对的系统发育树表明，ALAD 蛋白质与所用到的九种植物中高度同源（图 1A）。如图1B所示，辣椒ALAD蛋白与茄子蛋白的关系最为密切；茄科5个物种和拟南芥的ALAD蛋白形成了一个支持度高的进化分枝，而三个单子叶植物的蛋白质形成了第二个支持度高的进化分枝，这也表明ALAD在高等植物中是一种高度保守的蛋白。结构域预测结果表明，CaALAD 包含一个 ALAD 域，这意味着 CaALAD 属于 ALAD 家族（图 1C）。与结构域预测结果一样，预测的三级结构也表明CaALAD蛋白由一个主要部分组成，蛋白中有许多折叠和卷曲（图1C）

3.2 CaALAD在本氏烟草中的亚细胞定位及CaALAD在拟南芥中的过表达

亚细胞定位分析表明，对照 EGFP 荧光信号均匀分布在整个本氏烟草叶表皮细胞中，而来自CaALAD -EGFP 融合蛋白的信号则定位于叶绿体（图 2）。

与正常培养条件相比，暴露于低温胁迫 1 周后转基因植物的生长如图 3B、C所示。然而，过表达CaALAD的转基因植物在低温胁迫后的生长明显好于WT植物，并且转基因植物在低温下受到的损伤比WT植物少。

3.3 CaALAD的过表达增加了转基因拟南芥耐寒基因的转录

为了确定CaALAD对转基因拟南芥耐寒性的影响，在低温胁迫过程中不同时间测量了6个低温胁迫相关基因AtCBF1、AtCBF2、AtICE1、AtICE2、AtCOR15a和AtCOR15b的相对表达量（图4）。为响应低温胁迫，AtCBF1在WT和CaALAD转基因株系中的转录均先急剧上升，然后下降，并在2 h时达到最高表达水平（图4A）。与 6 h 相比，低温胁迫下 12 h WT 中的AtCBF1表达迅速下降了97.3%，但在 OE9 和 OE16 中分别下降了 34.1 和 4.8%（图4A）。AtCBF2的表达情况与AtCBF1的相似。AtCBF2的相对表达在 2 h 也迅速增加，然后从 6 到 48 h 逐渐下降（图4B）。转基因植物中AtCBF2在0小时的初始表达是WT中的2倍（图4B）。在2小时时，与WT相比，OE9和OE16系中AtCBF2的表达分别增加了 1.1 倍和 1.6 倍（图 4B）。在 12 h 时，与 6 h 相比，WT 中AtCBF2的表达急剧下降了 96%，而OE9 和OE16中 AtCBF2 的表达分别仅下降了 53.8 和 63%（图4B）。低温胁迫后，AtICE1在WT中的表达下降，而AtICE1在两个转基因株系植物中的表达在2 h后上升，然后下降，然后在24 h时上升（图4C）。在 2 h，AtICE1的表达与WT相比，在 OE9 和 OE16 植物中分别增加了 11.2 倍和 10.9 倍（图4C）。在低温胁迫期间，AtICE2在WT中的相对表达先升高，6 h后显着降低（图4D）。而在低温胁迫下AtICE2在转基因植物中的相对表达量从6到12小时逐渐降低，然后在24小时时增加2到3倍，然后在48小时再次降低（图4D）。在0小时，与WT相比，AtICE2在OE9和OE16植物中的相对表达分别增加了 1.9倍和2.1倍（图4D）。AtCOR15a的相对表达在WT和转基因植物中的表达迅速增加，从低温胁迫2h开始，但转基因植物中的表达在48h时下降，而 WT 中的表达在 48 h 时达到峰值（图4E）。作为对低温胁迫处理的响应，AtCOR15b在WT和转基因植物中的相对表达表现出相似的特征，首先表达增加然后减少（图4F）。AtCOR15b在WT中的表达水平在6小时达到峰值，而在OE系中的表达水平在12小时达到峰值。转基因植物中AtCOR15b的相对表达在2、6、12和 24 小时显着高于 WT（图4F）。

3.4 CaALAD的过表达参与转基因拟南芥植物抗氧化系统的调控

为了进一步确定CaALAD是否参与调节拟南芥的耐寒性，我们进行了组织化学染色，测定了低温24 h后H2O2和O2–的含量以及抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性。与暴露于低温胁迫后的 WT 植物相比，转基因 (OE) 植物被 NBT 和 DAB 染色的强度较低（图 5A，B）。在低温处理24 h后，WT和转基因植物中H2O2和O2–的含量以及SOD 、 POD和CAT的活性均增加（图5、6）。WT中H2O2和O2–含量显着高于转基因植株（图5、6 ）。低温胁迫后，OE9和OE16植株的O2–含量分别较WT下降29.6%和27.5%，H2O2含量分别较WT下降22.3%和17.8%（图 5B，D）。此外，在冷胁迫 24 h 后，与 WT 植物相比，OE9 和 OE16 植物抗氧化酶活性分别增加了42.4%和54.0%（SOD）、30.3% 和30.5%（POD）和 14.6% 和 18.3%（CAT）（图 6）。

3.5 CaALAD的过表达参与转基因拟南芥叶绿素生物合成的调控

ALAD蛋白催化两分子的ALA缩合为PBG，可影响叶绿素的生物合成。在本研究中，测量了低温胁迫下转基因和野生型拟南芥植物中 PBG、Proto IX、Mg-proto IX、Pchl 和 Chl 的含量。结果表明，在正常和低温条件下，转基因植物的PBG含量均显着高于WT植物（图7）。WT和转基因拟南芥植物的PBG含量在低温处理1天后显着增加（图7）。此外，低温胁迫下转基因植物中Proto IX、Mg-proto IX、Pchl和Chl的含量显着高于WT植物（图8）。低温胁迫7天后，OE9和OE16转基因植株的Proto IX分别增加了18.1%和15.3%，Mg-proto IX分别增加了20.9%和13.2%，Pchl分别增加了15和16.8%，Chl a分别增加了14.6%和16.1 %，与 WT 相比，Chl b 增加了 20.1% 和 21.6%，总 Chl 分别增加了 16% 和 17.5%（图 8）。

总结

该研究首次表明ALAD基因的表达对低温胁迫有反应。ALAD通过参与调控耐寒基因的转录、增强抗氧化系统和增强叶绿素合成来提高耐寒性。此外，ALAD还可能通过参与硫化氢介导的信号通路来应对低温胁迫。这些结果表明，ALAD是辣椒低温胁迫响应的重要基因。

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原文链接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.884990/full

补充材料：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.884990/full#supplementary-material

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