编译：微科盟黄瑞林，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

土壤抗生素抗性主要是由细菌群落组成决定的。然而，植物微生物群的抗生素耐药性及其与土壤-植物系统中土壤微生物组的关系在很大程度上仍是未知的。在这里，通过使用高通量qPCR和16S rRNA测序，我们研究了在不同耕作制度（水稻单作、黑麦草-水稻和野豌豆-水稻轮作）、生长时期（早期、分蘖期和收获期）和生境（土壤、根面和叶际）中，细菌与抗性基因（主要是抗生素抗性基因，ARGs）和可移动遗传元件（MGEs）之间的联系。结果表明，生境是影响细菌、RGs和MGEs分布的主要因素，而耕作制度对其影响较小。ARGs、多药耐药基因、金属耐药基因和整合子的相对丰度在土壤中最高，在叶际中最低，土壤和植物微生物群的α多样性也是如此。最重要的是，我们发现细菌在根面中与RGs和MGEs的关联最强，而不是在土壤和叶际中，这可能是由于根面细菌之间的高度网络相互作用。这些结果表明，根面可能是土壤-植物系统中ARGs交换的热点。

论文ID

原名：Habitat determines the relationships among bacteria, resistance genes and mobile genetic elements in the soil–plant system

译名：生境决定了土壤-植物系统中细菌, 抗性基因和可移动遗传元件之间的关系

期刊：European journal of soil science

IF：4.949

发表时间：2021.5.12

DOI：https://doi.org/10.1111/ejss.13132

通讯作者：梁玉婷

通讯作者单位：中国科学院南京土壤研究所

背景

越来越多的研究表明，抗生素抗性基因（ARGs）在微生物尤其是病原微生物中的获得和传播，可能是威胁人类健康的重要途径，如通过植物微生物群界面。在土壤-植物系统中，大量施用有机肥，如动物粪便，加剧了这种威胁。有机肥富含养分和有机质，施用后可提高土壤肥力，促进作物生长；然而，它们也含有高水平的抗生素，抗生素耐药菌（ARB）、ARGs和可移动遗传元件（MGEs），如转座子、整合子和质粒。这些MGEs可以促进ARGs从粪源ARB向土壤细菌的水平基因转移（HGT）。因此，由于粪肥中抗生素的选择性作用以及ARB和ARGs的传播，施用粪肥的土壤被认为是抗生素抗性的储存库。多项研究报告称，在施用有机肥的土壤中，植物微生物群（如莴苣、番茄和胡萝卜）中的ARGs丰度较高。此外，通过分析鸟粪石、土壤、根际和叶际中ARGs和MGEs的分布，Chen 等人指出，细菌可以作为ARGs从鸟粪石转移到根际甚至叶际的载体。这一结果表明，某些ARB的扩散可能是增加ARGs含量的一个重要途径。然而，尽管研究表明细菌群落组成决定了土壤中的ARG含量，但其与土壤-植物系统中植物微生物群抗性的关系仍不清楚，尤其是在不同的耕作制度下。本研究基于高通量qPCR和细菌16s rRNA测序技术，在不同耕作制度（水稻单作、黑麦草-水稻和野豌豆-水稻轮作）、生长时期（早期、分蘖期和收获期）和生境（土壤、根面和叶际）下检测了58个抗性基因（RGs）和21个可移动遗传元件（MGEs）。植物根部周围养分和碳源的高可用性有利于细菌的生长和繁殖，预计这将增加水平基因转移。并且因为根际细菌比土壤和叶际细菌具有更强的相互作用。因此，我们假设细菌群落组成和微生物抗性之间的联系在根面中最强，这将导致根面成为土壤-植物系统中ARG交换的热点。

结果和讨论

1 RGs、MGEs和细菌群落在土壤-植物系统中的分布

耕作制度、生境和生长时期对RGs、MGEs和细菌群落的影响使用主成分分析（PCA）和三个非参数多变量分析。结果表明，无论是RGs、MGEs还是细菌，它们的分布主要受生境的影响，其次受生长时期的影响，而不同耕作制度对它们的分布没有显著影响（图S2，表S3）。这一结果可能是因为RGs和MGEs都主要由其宿主细菌控制。相比于生长期和短期的绿肥种植（表S4），不同生境间在资源（如水分含量和养分可利用性）和物理化学性质（如pH值）方面显著差异。因为资源和理化性质是影响细菌群落组成的主要非生物因素，因此，细菌主要受生境的影响。基于这些结果，我们重点研究了RGs、MGEs和细菌的差异以及它们分别在不同植物隔室中的关系。

图1 生境对抗性基因、可移动基因元件和细菌的影响。

我们发现RGs（如ARGs、MRGs和MDRs）和MGEs（如整合子）在土壤中的相对丰度最高，其次是根面，而除质粒和转座子外，它们在叶际中的丰度均最低（图1a和b）。此外，细菌群落多样性也表现出类似的格局，即土壤中的α-多样性最高，叶际中的α-多样性最低（图1c和图s3）。可以预期，土壤具有最高的资源异质性，而叶际具有相对均质的资源和高光暴露。但是，对于不同的细菌分类群，它们的相对丰度并不总是与细菌多样性在不同生境的分布模式一致（图1d）。例如，我们发现变形菌和蓝细菌的相对丰度在叶际中最高，而在土壤中最低。与之前的研究一致，我们的研究结果表明，变形菌是叶际细菌中的优势细菌。然而，与一些关于植物叶际微生物组的研究（例如，拟南芥、水稻和莴苣）不一致，我们发现蓝细菌在水稻叶际细菌群落中也占有很大比例。一些研究表明，许多蓝藻成员具有很强的多生境定殖能力，包括在根际和叶际定殖。这一结果意味着一些具有多生境适应性的细菌（例如，蓝细菌）可以主动和/或被动地从土壤转到根表面，甚至到植物叶片。这一过程可能增加土壤-植物系统中细菌群落的联系，从而影响抗生素耐药群体与RGs和MGEs之间的关系。

2 土壤-植物系统中细菌、RGs和MGEs之间的关系

通常认为RGs可以通过MGEs在不同细菌细胞之间水平转移（例如整合子、质粒和转座子）。因此，RGs的丰度可能与MGEs的丰度呈正相关。在本研究中，基于线性拟合分析，我们的结果证实了RGs和MGEs之间存在显著的正相关（p < 0.001，图S4a）。但是，我们发现只有18%（图S4a中的r2）的RGs变化可以用MGE变化来解释。这一结果可能是因为RGs和MGEs之间的相关性会受到RGs类型和MGEs类型的影响。例如，结果表明，在同一生境中，ARGs与整合酶基因的相关性高于其他类型的RGs和MGEs的相关性（图S4b）。除HGT途径外，某些携带单一或多重耐药基因的ARB的生长和繁殖可能也是增加RGs丰度的重要途径，因为这些ARB可能能够在不同的植物区室之间传播，从而削弱了给定生境中RGs和MGEs之间的相关性。此外，我们发现RGs和MGEs之间的相关性强度不仅受基因类型的影响，还受生境的影响（图S4b）。具体而言，RGs和MGEs之间的相关性在根面中最强，其次是叶际和土壤中。这一结果意味着根面可能是HGT的关键位点。

在本研究中，我们发现几乎所有的58个RGs（包括8个MRGs）和21个MGEs同时在土壤、根际和叶际中被检测到（表S2）。这一结果表明，土壤、根际和叶际中的RGs和MGEs之间可能存在密切的相关性。考虑到生境内可能存在内在抗性组，我们将RGs和MGEs分别分为“共享”和“独特”两类。共享的RGs和MGE指在两个或两个以上的生境中，相同的RG或MGE与同一门水平的相同细菌显著相关（土壤、根际和叶际）。例如，intl1被归类为共享基因，因为它与土壤和根面中与变形菌门均显著相关（图S5a）。因此，当仅在一个生境中出现显著相关性时，RGs和MGEs被定义为“独特”基因。例如，tetT被归类为独特基因，因为它仅与土壤中的放线菌显著相关（图S5b）。我们发现，无论生境如何，共享RG的数量和总丰度都显著高于独特RG的数量和总丰度（图S5和表S5）。此外，我们的结果表明，尽管在不同生境中共享基因的相对丰度没有显著差异（图S6），但共享基因和细菌群落组成之间的相关性在根面比在土壤和叶际更强（表S5）。先前的研究已经表明，ARGs可以通过细菌作为传播载体从鸟粪石转移到植物表面。因此，共享RGs和细菌之间的高度联系意味着共享RGs可能具有在土壤-植物系统中传播的高风险。

图2 细菌与共享RGs和MGEs以及与独特RGs和MGEs之间的关系。

我们进一步使用Mantel路径分析来评估土壤、根面和叶际细菌之间的顺序关系，并确定它们是否会影响RGs和MGEs之间的关系。结果表明，相邻生境细菌群落组成之间存在显著相关性（图2，p < 0001)。并且，我们发现细菌群落组成的变化不仅可以直接影响本地生境中RGs和MGEs的丰度，还可以通过改变邻近生境细菌的群落组成而间接影响其丰度。此外，与土壤和叶际相比，基因和细菌群落之间的相关性在根面中最强（图2和表S5）。这一结果可能是由于植物生长过程中产生的植物粘液和根系分泌物能在短时间内为根面细菌提供丰富的有机碳。这一过程可以增加ARB的相对丰度，并直接增强根面抗性组。同时，高养分利用率有助于提高微生物活性。微生物活性的增加可能有助于HGT，这有望加强细菌与RGs和MGEs之间的关系。因此，与叶际和土壤相比，细菌与根面中的RGs和MGEs具有最高的联系（图3c）。

3 不同生境中细菌、RGs和MGEs之间相互作用的变化

研究表明，细菌群落组成可能是土壤RGs的决定因素。在这项研究中，我们发现细菌对RGs和MGEs的影响因生境而异（图2和3c）。除了资源可获得性和理化性质等非生物因素外，这可能也因为不同生境中微生物之间相互作用的差异造成的。研究表明，增强的种间相互作用可能会通过增加细菌接合来提高微生物中HGT的频率。这一过程将促进细菌与RGs和MGEs的连接。在我们的研究中，基于对细菌共生网络的分析，我们发现根面微生物之间存在很强的网络相互作用（图3a和b）。具体而言，根面细菌网络的边数、聚类系数、网络密度和平均网络度均显著高于土壤和叶际，而这与基因是共享的还是独特的无关（表S6）。由此说明，根面细菌与RGs和MGEs之间有很强的关系（图3c）。相反，土壤和叶面中细菌群落与RGs和MGEs之间的关系没有显著差异，细菌之间的相互作用的差异也较小（图3）。

图3 细菌与共享RGs和MGEs以及与独特RGs和MGEs之间的网络互作关系。

结论

基于细菌16s rRNA测序和RGs和MGEs的高通量定量PCR，我们发现虽然细菌的α-多样性和RGs和MGEs的丰度在根面中并不是最高的，但是细菌与根面中的RGs和MGEs的关联最强，而不是土壤和叶际中的。此外，根面细菌之间的网络相互作用比土壤和叶际细菌之间的网络相互作用更强。这些结果表明，根面可能是土壤-植物系统中ARG交换的热点。我们的研究结果表明，作物-植物系统是ARG传播的重要媒介。此外，阻止或干扰ARG在植物根际土壤中的转移，对于控制ARG从污染土壤向作物以及人类和动物传播的风险可能是有价值的。

引文：Ruilin Huang, Jixian Ding, Yuwei Guo, Bo Sun & Yuting Liang. Habitat determines the relationships among bacteria, resistance genes and mobile genetic elements in the soil–plant system. European Journal of Soil Science , doi: https://doi.org/https://doi.org/10.1111/ejss.13132

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