mSystems：南土所梁玉婷组-土壤pH过滤稻田土壤耐铝微生物的关联模式

摘要

土壤微生物被认为是植物的第二基因组。了解耐铝微生物的分布和网络关系有助于缓解酸性土壤中铝对植物的毒性。本研究中，检测了pH值范围在3.6到8.7之间的水稻土中可溶性Al³⁺含量和携带耐铝基因的细菌群落。在pH值小于5.1的酸性土壤中，Al³⁺含量显著增加。酸性土壤中存在丰富多样的耐铝微生物，包括Clostridium、Bacillus、Paenibacillus、Desulfitobacterium和Desulfosporosinus等。此外，与中性和碱性土壤相比，耐铝微生物的网络结构更为复杂。通过pH步长为0.01的定向网络分析主要耐铝微生物类群在生态网络中的潜在作用，结果发现网络中影响类群具有更宽的生态位和更多抗氧化功能基因来抵抗铝胁迫，表明它们比敏感类群具有生存优势。本研究首次探索了区域稻田土壤中耐铝微生物的分布，揭示了它们在pH介导下的潜在关联，为酸性农用土壤中微生物资源的进一步利用提供了基础。

研究背景

酸性土壤约占全球可耕地的30%，与其相关的铝（Al）毒严重限制了全球作物生产。在pH小于5的土壤中，铝将以可溶性Al³⁺的形式存在。酸性土壤中微摩尔浓度的Al³⁺将严重干扰土壤生物群落的正常代谢活动，并对植物产生毒性影响。人为活动和/或酸雨导致的土壤酸化持续增加将进一步加剧铝毒问题并降低农业生产效率。目前的研究主要集中在植物的耐铝机制上，包括耐受和排斥机制，而对微生物的耐铝性关注较少。

被称为植物第二基因组的微生物也具有多种耐铝特征，这些特征可能在缓解植物生长压力方面发挥重要作用。能够耐受高浓度铝（例如，超过100 µM或高达200 mM）的微生物被称为耐铝微生物。例如，红酵母菌株RS1可以通过增厚其细胞壁耐受高达200 mM的铝毒性。一些微生物通过分泌有机酸，在细胞外螯合Al³⁺来降低铝毒性。蓝藻可以通过增加多酚、类黄酮和谷胱甘肽水平以及过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性来诱导抗氧化防御系统，以抵抗铝诱导的氧化胁迫。根际土壤中的克雷伯菌和沙雷氏菌可通过形成Al³⁺和铁载体复合物来缓解铝胁迫。以往对耐铝微生物及其耐铝机制的研究大多集中在分离的超耐铝微生物菌株上，尤其是真菌（如Aspergillus flavus, Penicillium species, Penicilliumjanthinellum和Trichoderma asperellum）和酵母菌株（如Cryptococcus humicola, Rhodotorula glutinis和Rhodotorula species）以及一些细菌菌株（如Pseudomonas fluorescens和Burkholderia species）。微生物携带多种编码耐铝蛋白的基因，如AANH_like、AAT_I、Alr1p_like、YnbB等。为了更好地探索耐铝微生物资源及其在酸性土壤中帮助作物降低铝毒性的潜在功能，有必要在群落水平上研究耐铝微生物，并阐明影响群落的因素。

土壤pH是影响微生物群落多样性、相互作用、活性和功能的最重要环境因素之一。因为微生物的生长和活性具有不同最佳pH值范围，土壤pH对微生物可能产生直接过滤作用。土壤pH会影响土壤特性，包括Al³⁺含量和养分有效性，从而影响微生物群落结构和关联模式。例如，有研究发现，由于低pH值不利的细菌生长，会降低细菌的适应性，而促进真菌的生长，细菌和真菌之间的竞争沿pH梯度（pH 4.0到8.3）变化。反过来，这些变化可能会改变微生物群落的功能。在大多数土壤中，Al³⁺含量显著增加并产生毒性的临界pH值为5.0。然而，目前尚不清楚土壤pH值如何改变耐铝微生物的多样性和关联性。为了开发适合在特定土壤pH条件下生长的耐铝微生物资源，需要在pH范围下研究耐铝微生物的多样性和关联模式。

微生物网络分析已被广泛用于探索复杂环境中的微生物关联。虽然共生网络可能并不总是反映真正的生态关联，但它有助于理解微生物群落的复杂性如何随着环境因素的变化而变化。最近，有向网络被用来推断生态网络中关联的方向性。此外，定向网络揭示的群落中微生物之间的依赖性可能对它们的功能有影响。因此，这可能为理解不同耐铝微生物类群在群落中的作用提供了机会。

本研究中，我们分析了pH值范围在3.6到8.7之间的水稻土中可溶性Al³⁺含量和耐铝微生物群落的分布，在pH连续梯度范围内构建了定向网络以探索耐铝微生物之间的关联，确定在关联网络中不同微生物类群的生态位宽度和主要影响因素。本研究提出了以下假设（图1）：（i）在水稻土中，pH过滤耐铝微生物的多样性和潜在关联；（ii）网络中有影响力的物种在维持酸性水稻土群落水平的耐铝性中起着重要作用。

图1 本研究的假设

结果

耐铝细菌和功能基因在稻田中的分布

在中国从北到南13个采样区的水稻土中交换性Al³⁺含量存在显著差异（图2a）。Al³⁺含量随着土壤pH值的增加呈指数下降（R²=0.56，P<0.01）。当土壤pH<5.1，pH值越低，Al³⁺含量越高。此外，交换性Al³⁺含量还与土壤有机质、氮、磷含量等土壤性质和气候条件有关。

根据GeoChip 5.0检测到的携带耐铝功能基因的微生物，确定耐铝细菌群落。共检测到233个耐铝功能基因，其微生物源被认为是潜在的耐铝微生物，隶属于92个属。在16S测序的55519个OTU中，发现461个OTU（0.83%）属于这92个属，这些OTU被推断为耐铝微生物，用于后续分析。各采样区耐铝细菌的Shannon指数和丰富度各不相同（图2b和c）。在铝含量较高的样点，耐铝细菌的Shannon指数和丰富度并没有显著提高。铝含量可能不是耐铝细菌群落的最重要驱动因素。冗余分析耐铝细菌的生物地理分布模式（图2d），耐铝细菌群落结构受年平均气温（MAT）、年平均降水量（MAP）、土壤pH、阳离子交换量（CEC）、有机质（OM）、有效磷（AP）和交换性Al³⁺含量的影响（P=0.001）。偏Mantel分析表明，土壤pH是影响耐铝细菌群落的最重要土壤因素。同样地，微生物耐铝基因的丰度随土壤pH值变化，编码耐铝蛋白的功能基因，如AANH_like、Beta_elim_lyase、MetC、QueC、Met_gamma_lyase等，在pH<5.1的土壤中比pH>7和5.1<pH<7土壤中的更多（图3a）。由于抗金属氧化胁迫是酸性土壤中微生物耐受铝毒性的重要机制，本研究分析了微生物抗氧化功能基因的多样性，包括cat_arc、cat_bac、cat_fun、per_arc、per_bac、per_fun、sod_CuZn、sod_FeMn和sod_nickel。在pH<5.1的土壤中，抗氧化功能基因的丰富度和多度最高，其次是5.1<pH<7的土壤，pH>7土壤中的最低。AAT_I、Met_gamma_lyase和其他耐铝基因的丰度与这些抗氧化基因的丰度显著相关（r=0.30-0.81，P<0.001），Alr1p_like的丰度与cat_arc、cat_bac、cat_fun、per_arc、per_bac和per_fun的丰度显著正相关（P<0.05），YnbB的丰度与cat_bac、per_bac、per_fun、sod_CuZn和sod_FeMn的丰度相关（P<0.05）。

耐铝细菌和耐铝基因之间的网络在三个pH范围内表现出不同的关联模式（图3b）。pH<5.1时，网络最为复杂，细菌类群和耐铝基因之间有着紧密的联系。相比之下，在pH>7的土壤中耐铝细菌和耐铝基因的关联很少。这些结果表明，土壤pH值是决定耐铝细菌和耐铝基因多样性及其关联模式的关键因素，在pH值小于5.1时，耐铝细菌和耐铝基因的多样性最高，关联性最强。

图2 水稻土中耐铝微生物的分布

图3 三种pH范围内耐铝微生物与耐铝基因的关联

定向网络区分微生物的不同作用

为了进一步探索耐铝微生物在低pH胁迫下的潜在作用，构建了一个可以推断其潜在交互关系的定向网络。使用四种噪声（黑色、棕色、粉色和白色）来评估每个pH值范围内微生物群落的依赖性，黑色的依赖性最强，白色表示没有依赖性。非白噪声类型的较高百分比（50%）表明，在pH<5.1的范围内，细菌之间的依赖性更强。根据酸性土壤（pH<5.1）中定向网络的入度（指向该节点的关联数，表示该物种受其他物种影响的程度）和出度（由该节点指出的关联数，表示该物种影响其他物种的程度），耐铝微生物被划分为三个功能类群：影响类群（仅有出度）、敏感类群（仅有入度）和双向类群（出度和入度都有）（图4a）。这些微生物主要属于Clostridium、Bacillus、Paenibacillus、Desulfitobacterium和Desulfosporosinus。敏感类群的Shannon多样性以及影响类群和敏感类群的相对丰度高于双向类群，而双向类群的丰富度更高（P<0.05）（图4b）。

NMDS分析表明MAP和pH是解释影响类群结构变化的主要因素（MAP解释12.90%，pH解释11.90%），溶解有机碳（DOC）和Al³⁺含量对敏感类群结构的贡献更大（DOC解释12.30%，Al³⁺解释8.33%），双向类群的群落结构以MAP（18.30%）、交换性Al³⁺（15.20%）和pH（12.50%）解释最多。

图4 在定向网络中三种微生物类群的作用和多样性

三种耐铝微生物类群的生态位宽度和潜在抗性

生态位分析解释了耐铝细菌群落中三个类群的不同反应。在所有pH条件下，与其他两个类群相比，敏感类群群落水平的Bcom值显著更低，表明敏感类群通常占据环境中最小的生态位宽度（图5a）。影响类群和双向类群的生态位宽度在pH>7条件下比敏感类群大23.4%和67.7%，在5.1<pH<7条件下比敏感类群大27.7%和73.6%，在pH<5.1条件下大161.7%和147.7%。在pH<5.1时，敏感类群与影响类群和双向类群的生态位宽度差异更大。在pH<5.1条件下，敏感类群的生态位宽度要比在5.1<pH<7和pH>7条件下的明显更小，表明低pH值的胁迫缩小了敏感类群的生态位宽度。相比之下，影响类群和双向类群可能受低pH胁迫的影响较小，甚至因为其生态位宽度更大而得到促进。相比影响类群（前两轴解释量为16.0%）和双向类群（前两轴解释量为8.0%），主要的气候和土壤因素解释了敏感类群群落组成（前两轴解释量为26.4%）的更多变化（图4c）。敏感类群的群落组成受低pH胁迫的影响（r2=20.3%，P<0.001）大于影响类群（r2=6.6%，P<0.001）和双向类群（r2=18.9%，P<0.001）。

为了进一步了解铝耐受的机制，将三个类群的群落组成差异与微生物抗氧化基因的差异进行关联分析（图5b）。总的来说，影响类群与抗氧化基因的联系最强，包括cat_arc、cat_bac、cat_fun、per_arc、per_bac、per_fun、sod_CuZn、sod_FeMn和sod_nickel。敏感类群仅与cat_bac、sod_FeMn和sod_nickel相关。结果表明，抗氧化基因组成与影响类群的群落结构更相关，而与敏感类群的相关性较小。

图5 三个功能类群的生态位宽度及其与抗氧化功能基因的关系

结论

对区域水稻土中耐铝细菌群落的研究表明，土壤pH值是交换性Al³⁺含量以及耐铝微生物群落多样性和关联模式的主要决定因素。耐铝微生物在pH<5.1的酸性土壤中表现出最复杂的网络结构和潜在的功能相互依赖性。本研究首次在群落水平揭示了耐铝微生物的分布特征。通过构建有向网络，从影响类群、敏感类群和双向类群之间的功能关系推断微生物在耐逆性方面的潜在相互依赖性。微生物在网络关联中的不同功能作用部分是由微生物之间的生态位差异驱动的。从微生物群落中鉴定出的功能类群在开发微生物资源以减轻铝毒性和促进作物生长方面具有潜在的应用价值。本研究为进一步利用酸性农田土壤中的微生物资源提供了依据。如果植物促生细菌对铝敏感，它们可能会在群落中受到其他高抗性物种的保护。通过调整影响类群的比例，可能可以提高根际和植物微生物群对铝胁迫的耐受性。

Reference

参考文献

Na Zhang, Zhiyuan Ma, Do Li, Haowei Ni, Bo Sun, Yuting Liang. Soil pH filters the association patterns of Aluminum-tolerant microorganisms in rice paddies. mSystems, 2022(7):e01022-21. DOI:10.1128/msystems.01022-21

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作者简介

【第一作者】

张娜：硕博毕业于中国科学院南京土壤研究所，主要研究方向为土壤微生物生态，目前以第一（共同第一）作者在mSystems、Biology and Fertility of Soils、Geoderma、Applied and Environmental Microbiology和Soil Biology and Biochemistry等发表SCI论文5篇。

【通讯作者】

梁玉婷：中科院南京土壤研究所研究员，博士生导师。清华大学学士、博士，University of Oklahoma访问学者、博士后。从事土壤微生物学领域的研究，近年来在农田土壤微生物组功能与稳定机制方面取得了较为系统的研究成果,揭示了我国不同气候带典型农田土壤中微生物群落结构特征及碳氮耦合转化、地力提升功能的演变规律等。发表SCI 60余篇，中文核心10余篇。承担国家自然科学优秀青年基金、江苏省杰出青年科学基金等，中科院青促会优秀会员，担任《土壤学报》、Soil Ecology Letters等编委，中国土壤学会土壤质量标准化委员会主任、江苏省土壤学会学术工作委员会主任。

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编辑 | 倪浩为

审核 | 梁玉婷

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